编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

脂肪组织功能障碍与肥胖及其相关的流行病有关，如2型糖尿病（T2DM）、心血管疾病和某些癌症等。对于脂肪异常增加（肥胖）或减少（脂肪萎缩）的个体来说，改变脂肪组织储存甘油三酯（TG）的能力可以调控胰岛素抵抗和相关代谢并发症。在哺乳动物中，WAT（White adipose tissue，白色脂肪组织）储存能量，而BAT（Brown adipose tissue，棕色脂肪组织）通过UCP1（Uncoupling protein 1, 解偶联蛋白1）介导的产热作用将能量转换成热量。研究发现在肾上腺素能刺激、寒冷或运动后，WAT中的棕色和米色脂肪细胞大量表达UCP1以产生热量。由于人体的BAT很少，白色脂肪的“棕色化”则是一种很有前途的对抗肥胖和代谢紊乱的策略。

线粒体是脂肪细胞生物学的中心细胞器。在BAT中，它们驱动非颤栗产热，这依赖于质子内膜泄漏，即线粒体上UCP1等解偶联蛋白将线粒体膜间隙的质子泄露到线粒体膜内，消耗质子梯度同时产热；脂肪酸β氧化（Fatty acid oxidation，FAO）和氧化呼吸链（即线粒体电子传递链Electron-transfer chain, ETC）则可以产生质子梯度。因此，ETC活性或FAO缺陷与肥胖和代谢性疾病密切有关。细胞对线粒体核心能量转换系统的控制可以通过线粒体形状和形态的动态调节来实现，从而精准调节呼吸效率和营养利用。因此，可以推测线粒体形态异常与肥胖相关代谢并发症的发生有关。之前有研究报道，糖尿病患者肌肉中与胰岛素抵抗和肥胖有关的线粒体融合或裂变蛋白水平更低，且线粒体嵴被破坏。利用条件敲除小鼠模型对脂肪组织中的线粒体融合和内质网束缚蛋白Mfn2进行研究，揭示了其在抑制BAT产热功能中的重要性。另外，在Opa1(Optic Atrophy 1, 视神经萎缩蛋白1)单倍体不足的小鼠模型中也出现类似的肥胖抵抗，BAT中的Opa1敲除通过诱导成纤维细胞生长因子21（FGF21）的表达和分泌来刺激WAT棕色化。从MFN1/2和Opa1等介导线粒体融合基因的相关研究模型可以推测脂肪组织线粒体融合更容易导致肥胖，但是目前还不清楚脂肪组织线粒体融合越多是否意味着肥胖的预后越差，更不清楚线粒体在白色到米色脂肪细胞转化中的作用。

基于此，近期发表在NatureMetabolism上的一篇题目为“The mitochondrial protein Opa1promotes adipocyte browning that is dependent on urea cycle metabolites”的文章发现了线粒体嵴形状和融合蛋白Opa1通过影响尿素循环和Jumanji家族组蛋白去甲基化酶Kdm3a使WAT发生自主棕色化。该研究首先发现在肥胖患者队列中，脂肪组织OPA1减少与体重增加之间在出现临床并发症之前就存在相关性。后续研究进一步证明了脂肪细胞Opa1可以调节脂肪组织的可扩张性，并通过一个包括尿素循环刺激、延胡索酸的积累和Jumanji家族组蛋白去甲基化酶Kdm3a的轴来促进WAT到BAT的重塑。

肥胖是由多种遗传和环境因素相互作用引起的一种代谢性疾病，那么，对同卵双胞胎的研究是否可以为获得性肥胖的研究提供帮助呢？于是作者研究了在BMI不一致(每对BMI的差异≥3 kg/m−2)的同卵双胞胎之间是否存在线粒体形态关键调控因子表达水平的差异。基因表达分析显示，在更重的孪生兄弟的SAT（皮下脂肪组织）中OPA1表达水平显著下调(图1A)，而MFN2和MFN1表达水平无显著差异(图1 B,C)。在线粒体裂变基因中，只有DRP1的表达在更重的孪生兄弟中显著升高(图1D,E)。有文献报道在肥胖的同卵双胞胎中线粒体转录特征下调，作者便进一步验证了OPA1和DRP1水平是否与线粒体基因表达相关。结果发现只有OPA1水平与线粒体基因表达增加显著相关(在瘦个体中表达更高)，而DRP1水平与线粒体基因表达之间的相关性并不明确(图1F,G)。另外，在将肥胖和胰岛素抵抗数据与这些线粒体形成基因的表达水平生成相关性回归模型时（进行年龄、性别和吸烟校正），发现只有OPA1表达与腹腔内脂肪量和胰岛素抵抗呈负相关（腹腔内脂肪量和胰岛素抵抗是代谢功能障碍的关键预测因子）(图1H)。最后，在III-IV期肥胖或肥胖且糖尿病患者VAT(内脏脂肪组织)中OPA1水平也降低，而其他线粒体形成基因水平在正常体重个体，肥胖或肥胖且肥胖患者之间相似(图1I-M)。综上所述，这些数据表明，脂肪组织中较低的OPA1水平与人类肥胖及其并发症之间存在联系。

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“分分合合”的线粒体

线粒体作为一个高度动态的细胞器，在细胞中不断进行融合与分裂，保持动态平衡，该过程主要由介导线粒体融合的MFN1/2、Opa1和介导裂变的Drp1调控。

线粒体裂变是指单个线粒体分成两个的过程。裂变过程有助于线粒体网络的重塑和重排、调控线粒体转运、促进细胞凋亡和清除功能失调的线粒体。调控裂变的Drp1是一种来自胞质溶胶的动力蛋白GTPase超家族的成员，其在线粒体和过氧化物酶体膜上表现出特定的裂变活性。哺乳动物中Drp1的募集涉及到4种单通道OMM蛋白：Mff(Mitochondrial fissionfactor, 线粒体裂变因子)、Fis1(Fission protein 1, 裂变蛋白1)和两种MiD蛋白(Mitochondrial dynamicsproteins, 线粒体动力蛋白)MiD49与MiD51。其中，MiD仅存在于脊椎动物的线粒体中，Mff存在于高等后生动物的线粒体与过氧化物酶体中，而Fis1则在所有真核细胞的线粒体与过氧化物酶体中广泛表达。这些蛋白的缺乏均会引起裂变活性的降低和线粒体的伸长。当这些募集蛋白表达并招募Drp1后，Drp1蛋白在线粒体上互相聚合形成环绕整个线粒体外表面的弯曲结构，并在收缩时利用GTP水解产生的能量夹断线粒体，从而起到裂变效果。

线粒体融合是两个线粒体膜合并为一个的过程。在融合过程中，线粒体之间能够交换内容物，有缺陷的线粒体可以重新获得呼吸链和线粒体DNA等基本成分，从而恢复其功能。由于线粒体是双膜细胞器，因此完全融合需要外膜和内膜的融合。外膜融合主要由MFN介导。当线粒体融合开始后，MFN之间互相结合形成寡聚体复合物，通过消耗GTP促进外膜的融合。线粒体内膜的融合则受到MFN1依赖性的OPA1调控。OPA1负责将蛋白锚定到线粒体内膜中，并调控线粒体嵴的形态和呼吸链复合物的稳定性。

图1. 肥胖患者的OPA1表达降低

为了研究脂肪组织OPA1水平的增加是如何与人类较低的BMI和更好的代谢疾病预后指标相关的，作者通过靶向转基因(Opa1^tg)构建了泛表达的轻度OPA1过表达的小鼠（Opa1^tg）（小编注：该实验室2015年发表在CM上的文章发现过度表达OPA1可能会引起线粒体断裂，从而产生一定毒性，因此使用了轻度OPA1过表达、即表达上调至约1.5倍且具有统计学意义的小鼠模型，其主要表型与WT鼠对比无明显改变，且可存活、可生育）。值得注意的是，9月龄Opa1^tg小鼠的SAT和VAT体积和质量均显著降低(图2A,B)，且Opa1^tg小鼠的脂肪细胞也小于对照组(图2C,D)。瘦素是由脂肪细胞按脂肪量的比例分泌，以维持能量稳态。作者研究发现Opa1^tg小鼠脂肪储存的减少与VAT瘦素转录水平的降低和瘦素循环水平的降低相关(图2E,F)。同时，Opa1^tg小鼠脂肪组织形态和功能上的改变与糖耐量和胰岛素敏感性的改善相关(图2G,H)。与同窝对照组小鼠相比，Opa1^tg小鼠对高脂饮食（HFD）诱导的肥胖略有抵抗(图2I)，且与食物摄入量无关(图2J)。当HFD喂养9周后Opa1^tg小鼠肝肝脏重量明显下降(图2K)。与HFD喂养的WT小鼠的肝脏脂肪变性加重相比，而Opa1^tg小鼠的肝脏脂肪变性程度大大减轻(图2L)。脂联素水平的降低和瘦素水平的升高(功能失调脂肪组织的一种典型分泌模式)可能导致脂肪在肝脏积累。HFD喂养9周后，与对照组WT小鼠相比，Opa1^tg小鼠的瘦素水平降低，脂联素水平升高(图2M,N)，葡萄糖耐量和胰岛素敏感性也相应得到改善(图2O,P)。这些数据表明，Opa1可能增强脂肪组织的可扩张性(expandability)，从而减少其他器官的脂毒损伤。

对HFD喂养的Opa1^tg小鼠BAT进行组织学分析，发现与同窝的WT小鼠相比，Opa1^tg小鼠BAT的脂肪细胞变小，且含有丰富的多房脂滴(图S1A)；BAT相关的转录变化也很明显：成脂基因(Pparγ, Pgc1β)和产热基因(CideA, Ucp1)显著增加，而线粒体生物发生基因Pgc1α没有增加(图S1B)。同时，即使是HFD喂养的Opa1^tg小鼠的SAT也显示出一些BAT特征(即Ucp1、Pparγ、Pgc1β诱导；图S1C)，表明Opa1可能在产热过程中发挥作用。对Opa1^tg小鼠的BAT功能进一步研究发现，在WT小鼠中，iBAT(肩胛间棕色脂肪组织)呈现典型的棕红色，而Opa1^tg小鼠的iBAT表现为更强烈的红褐色(图3A)。组织学分析显示，Opa1^tg小鼠的iBAT脂肪细胞较小且含有较多的多房脂滴(图3B)。免疫染色(图3C,D)和qPCR结果(图3E)显示与WT小鼠相比，Opa1^tg小鼠的iBAT中Ucp1水平增加。此外，Opa1^tg小鼠对急性冷刺激的耐受性更强(图3F,G)。在密闭的代谢笼中进行直接热量测量实验证明，Opa1^tg小鼠在RT室温(室温)和较低温度（18℃）下产生的热量更多(图3H)。在排除体重对基础产热的影响后，协方差分析(ANCOVA)检验结果进一步证实了Opa1^tg小鼠的产热能力更强(图S2A)。同时，在RT和18°C的代谢笼中，通过MRI测量确定的瘦肉和脂肪质量的热量数据进行归一化后可以明显看出产热依赖于脂肪质量(图S2B,C)。因此，Opa1可以刺激BAT功能。

图3. Opa1促进BAT产热活性

Opa1^tg小鼠所有代谢参数的改善可能与BAT功能的改善有关，也可能与Opa1^tg WAT的改变有关。与WT小鼠相比，HFD喂养的Opa1^tg小鼠SAT中Ucp1的表达升高(图S1C)，这提示了Opa1可能促进WAT的棕色化。鉴于在小鼠SAT中，米色脂肪细胞主要与单房白色脂肪细胞共存。于是，作者比较了SAT和VAT之间Opa1和其他线粒体形成蛋白的水平。正如预期的那样，与VAT相比，在易发生棕色化的SAT中棕色化标记基因Ucp1、CideA和Cox8b显著富集。有趣的是，虽然VAT比SAT含有更多线粒体（小编注：此处引用文献为大鼠数据），但Opa1在SAT中表达较多，关键的线粒体生物发生基因以及Mfn1和Mfn2在VAT中表达较多(图S3A)。因此，与其他线粒体融合基因的主要不同之处在于，Opa1在小鼠体内易发生棕色化的脂肪中富集。更有趣的是，室温条件下，与WT小鼠相比，Opa1^tg小鼠SAT中的产热标记物表达更高(图4A)。当小鼠暴露于4 ℃时，Opa1^tg小鼠SAT可以检测到UCP1(图4B)，其转录水平是WT小鼠SAT中的28倍(图4C)。此外，Opa1^tg小鼠也更容易发生肾上腺素能刺激的WAT棕色化。在体内实验中，β3-肾上腺素能激动剂可导致Opa1^tg小鼠的SAT和VAT中以多房脂滴为特征的BAT样脂肪细胞的形成(图S3B)。总之，这些数据表明，Opa1水平与WAT的棕色化能力呈正相关。然而，这些数据并不能解释Opa1是否以细胞自主的方式刺激棕色化，也没有得到关于线粒体嵴生物发生和融合蛋白刺激WAT棕色化复杂过程的机制的线索。

为了解决这两个问题，作者提取了WT小鼠和Opa1^tg小鼠SAT的血管间质部分的前体脂肪细胞，发现在原代培养中，OPA1的促棕色化效应是细胞自主发生的，因此可以更好地研究棕色化的分子机制。在白色脂肪前体细胞培养过程中，通过标准培养基（对照组）或添加罗格列酮（一种PPARγ激动剂）和去甲肾上腺素的培养基（R+NE）分化7天后，检测棕色脂肪细胞标记物UCP1。发现在加药后的原代Opa1^tg前脂肪细胞中，Ucp1的绝对水平明显升高，这表明过表达Opa1可以使细胞自主地促进WAT棕色化(图4D-F)。接下来。对WT和Opa1^tg原代白色前脂肪细胞在标准培养基和添加R+NE培养基分化7天后的RNA-seq结果进行比较，发现在米色分化的WT和Opa1^tg脂肪细胞中分别有754和498个差异表达基因(图 4G,H)，这证实了Opa1在WAT前脂肪细胞米色分化过程中影响了基因表达，但并未说明它如何起作用。为了回答这个问题，还需要验证是否存在Opa1^tg特异性的差异表达基因(Differentiallyexpressed genes, DEGs)。Venn图结果显示，所有上调的基因中有37%对Opa1^tg前脂肪细胞分化具有特异性，而下调的基因中只有15%具有特异性(图4I)。在结果中，作者没有发现R+NE处理Opa1^tg前脂肪细胞会下调脂肪组织亚型中涉及的转录因子或辅助因子(图S4A)，因此作者对Opa1^tg前脂肪细胞米色分化过程中特异性上调的DEGs进行了更详细的分析。通过使用皮尔逊距离测量法，验证了这些DEGs中哪些基因与UCP1聚类，并检索到11个涉及不同过程的基因：泛素化(Arel1)、脂质代谢(Acacb和Ces1d)、转录(Pabpc4)、糖酵解(Eno1b和Slc2a1)、细胞骨架结构(Epb41)、线粒体生物发生(Ppargc1b和Ndufaf2)。其中，有两个基因值得注意：Tsukushi (Tsku，一种参与产热的肝脏因子）；Kdm3a(也称为Jmjd1A，一种Jumanji去甲基酶的成员，一种参与表观遗传调节的酶）(图4J)。然而，Tsku似乎抑制产热和棕色化(与Opa1的作用相反)，Kdm3a则通过控制Adrb1和Ucp1的H3K9甲基化状态来增加棕色/米色脂肪细胞的产热活性。IPA（ingenuity pathway analysis）（小编注：IPA是一款付费的生信软件，适用于转录组学、蛋白质组学、代谢组学等大数据分析，与传统KEGG分析相比，IPA可以更清晰的展现经典通路、上游转录调控、下游调控子效应、疾病与功能以及分子间相互作用网络的结果，尤其是对上下调的基因数据，以及pathway与代谢物、疾病与代谢物之间的关联做一个完整的整合分析，在这一方面其结果要优于KEGG）推断结果表明在Opa1^tg前脂肪细胞米色分化过程中，有潜在的上游Jumanji家族调节因子被过度表达。有趣的是，Kdm3a表达的关键调控因子HIF1α，以及其他几个缺氧相关调控因子如CREB、MYC和FLI1被预测在Opa1^tg前脂肪细胞米色分化过程中被激活(图S4B)。事实上，在Opa1^tg前脂肪细胞米色分化过程中，HIF1α的沉默抑制了Ucp1表达(图S4C)。此外，IPA分析揭示了一个关联网络，该网络中KDM3a和HIF1α是连接OPA1和UCP1的关键组分(图S4D)。于是，作者猜测Opa1和Kdm3a是否均在Ucp1转录调控的相同通路中，结果发现在WT和Opa1^tg原代白色前脂肪细胞中逆转录病毒介导的Kdm3a沉默(图S4E)并不影响WT细胞米色分化过程中Ucp1的诱导，而在Opa1^tg细胞中该刺激效应消失了(图4K)。这些数据表明，在脂肪细胞棕色化过程中，Opa1需要Kdm3a来刺激Ucp1的表达。

图S3. Opa1促进白色脂肪细胞的棕色化

图S4. Opa1^tg前脂肪细胞分化主控基因调控因子分析

接下来，作者继续探究Opa1^tg前脂肪细胞中延胡索酸的来源（延胡索酸盐是一种TCA中间体，但其他TCA中间体没有显著积累）。作者发现，在Opa1^tg小鼠前脂肪细胞中，尿素循环中间体(精氨酸、二甲基精氨酸、鸟氨酸、乙酰鸟氨酸)和由尿素循环中间体产生的多胺(精胺、亚精胺、腐胺)的水平显著升高(图5A)。MetaboAnalyst分析显示，Opa1^tg前脂肪细胞中氨基酸代谢和尿素循环的这些通路过度表达(图5C)。在Opa1^tg SAT的稳态代谢组学（小编注：稳态代谢组学不同于传统代谢组学的直接测量，是一种将代谢组学数据与代谢网络模型相结合并推断代谢通量的新型计算机分析方法）中，同样观察到精氨酸和多胺腐胺的增加(图S5A)。虽然稳态代谢组学几乎检测不到延胡索酸，但在直接检测中，它在Opa1^tg小鼠SAT中比在WT小鼠SAT中高两倍(图S4B)。MetaboAnalyst显示，成熟SAT中也存在类似的尿素循环过度表达(图S4C)。因此，作者接下来探究尿素循环中间体和延胡索酸是否在Opa1^tg前脂肪细胞的米色分化过程中存在特异性积累。通过比较WT和Opa1^tg前脂肪细胞和米色脂肪细胞的代谢组学数据，发现尿素循环中间体、多胺类和延胡索酸在Opa1^tg小鼠中高度表达；相反，瓜氨酸—精氨酸琥珀酸的关键前体，在尿素循环中转化为精氨酸和延胡索酸的程度被下调(图5D)。为了验证尿素循环与Opa1诱导的前脂肪细胞棕色化这一现象之间的关系，作者通过慢病毒shRNA沉默尿素循环限制酶氨甲酰磷酸合成酶-1(Cycle rate limitingenzyme carbamoyl phosphate synthetase-1, CPS1)和精氨酸琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase, ASL, 催化精氨酸琥珀酸裂解为精氨酸和延胡索酸)。结果发现，沉默CPS1或ASL对WT前脂肪细胞的棕色化没有影响，但其抑制Opa1^tg白色前脂肪细胞的棕色化，使其达到WT对照组水平(图5E)。值得注意的是，通过检测Ucp1的表达，发现细胞渗透的延胡索酸回补了由Opa1^tg前脂肪细胞Cps1沉默引起的棕色化下调，这表明尿素循环在Opa1促棕色化途径中起到了促进Opa1所需的延胡索酸生成的作用 (图5F)。

图5. Opa1通过尿素循环诱导促进脂肪细胞Ucp1的转录

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三羧酸循环与表观调控

研究表明，线粒体中TCA循环代谢物与DNA组蛋白修饰的动力学密切相关，因此，TCA循环的中间产物也可以参与调控表观遗传。例如，乙酰辅酶 A 和琥珀酰辅酶 A可以调控组蛋白乙酰化和琥珀酰化。组蛋白去甲基化酶的胺氧化酶家族成员LSD1(Histone lysine specific demethylase 1, 组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1)依赖TCA循环产出的FAD来进行质子转移，从而特异性地去除H3K4和H3K9位点上的单甲基化和二甲基化基团。此外，Jumonji(Jumanji)蛋白也是一个常见的受TCA循环产物调控的去甲基化酶，其催化去甲基化反应需要TCA循环异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸所产生的α-酮戊二酸(α-KG)。此外，α-KG向琥珀酸的转化也发生在DNA去甲基化过程中，其中10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶(ten-eleven translocation, TET)催化一系列氧化反应将α-KG和氧气形成的羟基转移到5-甲基胞嘧啶上形成5-羟甲基胞嘧啶，并继续氧化变为5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。

参考文献：

[1] Liu X et al. Signal TransductTarget Ther. 2021 Nov 3;6(1):375.

为了探究哪种代谢途径对延胡索酸在Opa1^tg前脂肪细胞中积累的贡献最大，作者分别使用[¹³C3]-丙酮酸和[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸进行示踪实验。[¹³C3]-丙酮酸用于分析TCA循环的贡献，[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸用于分析嘌呤从头合成和尿素循环对延胡索酸生成的影响。[¹³C3]-丙酮酸通量分析表明，与WT前脂肪细胞相比，M2延胡索酸（指来自TCA的延胡索酸）在Opa1^tg中增加了7% (图6A)。重要的是，线粒体中草酰乙酸转胺酶引起了天冬氨酸M2的显著增加(图6A，图S6)。这一结果与先前Opa1^tg前脂肪细胞稳态代谢组学记录的总天冬氨酸水平升高一致。这些数据表明，Opa1^tg前脂肪细胞的TCA循环有助于支持尿素循环中天冬氨酸的生物合成。另一方面，与WT前脂肪细胞相比，这些通量分析说明TCA循环来源的延胡索酸盐并不是先前观察到的Opa1^tg中延胡索酸盐增加180%的主要原因。通过[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸通量实验，作者探究了尿素循环和嘌呤合成对延胡索酸增加的相对贡献，发现在Opa1^tg前脂肪细胞中M4延胡索酸盐(来源于嘌呤从头合成或尿素循环)比WT细胞增加了160%。相反，在Opa1^tg前脂肪细胞中，TCA循环特异性M3延胡索酸盐增加了18%，M1一磷酸肌苷(IMP)标记减少了4%，这些结果表明通过嘌呤从头合成的通量没有被Opa1增强。因此，观察到的延胡索酸盐积累应当不是由嘌呤从头合成衍生的延胡索酸盐引起的(图6B)。值得注意的是，与WT前脂肪细胞相比，Opa1^tg中M1精氨酸有8%来自天冬氨酸¹⁵N的掺入，这表明Opa1更有利于氮从天冬氨酸到尿素循环，但会减少细胞质转氨到谷氨酸的过程（谷氨酸减少15%） (图6B)。

为了验证尿素循环是否与胞质延胡索酸积累存在因果关系，需要在Opa1^tg且Cps1下调的前脂肪细胞中进行同样的追踪实验。在Opa1^tg前脂肪细胞中使用慢病毒靶向Cps1(ShCps1)导致TCA循环活性降低从而降低[¹³C3]-丙酮酸通量。在ShCps1 Opa1^tg前脂肪细胞中，线粒体M2延胡索酸标记从7%变为1%(图6C)。Cps1沉默后，M1精氨酸中[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸中¹⁵N掺入增加量从8%下降到0%，这证实了尿素循环通量降低的有效性(图6D)。令人惊讶的是，在ShCps1后，没有再观察到M4延胡索酸标记的增加，而是减少了。此外，¹⁵N通过细胞质转氨在M1谷氨酸中的掺入量反倒增加了14%(图6D)。这些数据表明，尿素循环解释了Opa1^tg前脂肪细胞中延胡索酸的产生，并揭示了Opa1介导激活尿素循环活性和细胞质延胡索酸生成之间的因果关系。在这种情况下，TCA循环对于向尿素循环提供天门冬氨酸至关重要。

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延胡索酸来自哪里？

本研究通过同位素示踪法，通过加入[¹³C3]-丙酮酸和[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸，以此来研究不同循环中延胡索酸的合成占比。作者认为延胡索酸的合成主要包括三个来源，即TCA循环中琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸氧化形成延胡索酸、尿素循环中精氨酸代琥珀酸裂解酶(Arginino-succinatelyase, ASL)裂解精氨酸代琥珀酸生成延胡索酸和精氨酸、以及腺苷酸循环中嘌呤从头合成路径的腺苷酸基琥珀酸裂解酶（Adenylosuccinic acid, ADSL）分解腺苷酸基琥珀酸生成AMP和延胡索酸。

在本研究中，作者以延胡索酸中同位素个数n来确定为M_n型用以判断其产生来源。比如，通过[¹³C3]-丙酮酸生成乙酰辅酶A（两个C被同位素标记），并进入TCA循环。在该循环中，2个同位素标记碳应当被全部转移到延胡索酸中，因此通过检测M2（即2个同位素碳）的延胡索酸，便可以检测TCA循环在延胡索酸来源中的占比。而在加入[¹³C4,¹⁵N]-l-天冬氨酸后，通过检测Opa1^tg鼠中尿素循环和嘌呤从头合成途径合成的M4（即4个同位素碳）延胡索酸占比，以及TCA循环特异性M3延胡索酸和M1一磷酸肌苷(IMP)与WT鼠的比值，从而判断出延胡索酸的主要来源为尿素循环。

接下来，为了探究脂肪组织特异性Opa1缺失是否通过抑制尿素循环依赖的延胡索酸积累来损害前脂肪细胞的米色分化。作者将脂联素-Cre(adipoq-Cre)小鼠与Opa1^flx/flx小鼠杂交，产生了脂肪特异性Opa1基因敲除小鼠(Opa1^ΔAT)。由于脂联素是脂肪生成主要调控因子PPARγ2的下游靶点，因此可以确保成熟脂肪细胞中Opa1的选择性缺失。在12周龄的纯合子和杂合子的Opa1^ΔAT小鼠中，BAT和WAT中Opa1水平均下降(图S7A)。虽然摄食量没有显著差异，但Opa1^ΔAT小鼠的SAT和VAT重量显著减少(图S7B,C)，并导致脂肪量下降(图S7D)。此外，对3月龄Opa1^ΔAT小鼠的WAT进行组织学分析，发现脂肪细胞数量减少，这些脂肪细胞扩大并分散在纤维化和炎症组织中(图S7E,F)。考虑到这些组织形态缺陷，作者便探究Opa1缺失是否也影响脂肪组织的调节功能。脂联素主要由脂肪组织产生，控制全身新陈代谢和疾病易感性。Opa1^ΔAT小鼠分泌的脂联素水平显著降低，胰岛素水平显著升高(图S7G,H)。因此，OPA1是脂肪组织结构和内分泌功能所必需的。Opa1^ΔAT小鼠与WT小鼠体重无显著差异，而Opa1^ΔAT小鼠的肝脏大小和肝脏脂质累积增加(图S7I，J)，表现出肝脏脂肪变性。Opa1^ΔAT小鼠也存在葡萄糖不耐受(图S6K)和严重的胰岛素抵抗(图S7L)，表明Opa1维持脂肪细胞功能，其脂肪组织特异性缺失最终导致胰岛素抵抗。接下来作者研究了Opa1^ΔAT小鼠的BAT功能。WT小鼠的iBAT呈经典的棕红色，而3月龄的Opa1^ΔAT小鼠的iBAT则增大和呈乳白色，组织学分析显示Opa1^ΔAT小鼠iBAT的脂肪细胞具有混合的白棕色表型，特征是单房和多房脂滴(图S8A)。同样，在Opa1^ΔAT小鼠的iBAT中，UCP1(图S8B,C)以及其他棕色脂肪细胞标志物和线粒体调节因子的水平均降低(图S8D)。在冷刺激下，3月龄Opa1^ΔAT小鼠的产热活性(4°C暴露72h时维持体温的能力)显著降低(图S8E,F)。总之，这些数据确立了Opa1不仅在WAT的维持和功能中发挥重要作用，而且在BAT中也是如此。

接下来，作者探究了体内Opa1^ΔAT SAT和体外Opa1^ΔAT前脂肪细胞棕色化是否会受到影响。结果显示，β3-肾上腺素能刺激不能诱导Opa1^ΔAT SAT中UCP1或BAT样脂肪细胞的出现(图S9A,B)。稳态代谢组学表明，Opa1^ΔAT SAT中延胡索酸水平降低。利用MetaboAnalyst软件进行可视化分析后发现，包括尿素循环在内的相关通路出现下调，而在Opa1^tg SAT中延胡索酸水平则上调(图S9C,D)。另外，作者在Opa1^ΔAT前脂肪细胞的米色化诱导过程中，发现Opa1水平并没有上调，Ucp1也未被诱导表达，这证实了这些Opa1敲除细胞的米色化存在缺陷(图S9E)。接下来，作者通过稳态代谢组学研究了与对照(绿色荧光蛋白，GFP)感染的Opa1^f/f前脂肪细胞相比，携带Cre重组酶的腺病毒感染的Opa1^f/f前脂肪细胞在米色分化过程中延胡索酸水平是否也被抑制。值得注意的是，在Opa1缺失的前脂肪细胞分化过程中，不仅延胡索酸盐，尿素循环其他中间产物，如精氨酸、鸟氨酸、亚精胺和精胺也发生下调(图S9F)。最后，作者还检测了外源性延胡索酸是否可以挽救Opa1敲除所引起的前脂肪细胞的米色分化缺陷。结果发现，在Cre感染的Opa1^f/f前脂肪细胞的米色分化过程中，DMF可以刺激Ucp1的诱导(图S9G)。这表明，由于Opa1缺失导致的前脂肪细胞棕色化能力受损与延胡索酸水平的降低相关，并且Opa1^ΔAT前脂肪细胞棕色化可以通过补充外源性延胡索酸来挽救。

图S9. 脂肪细胞Opa1缺失通过降低延胡索酸水平损害前脂肪细胞棕色化

轻度过表达Opa1会导致尿素循环酶的表达增加。作者认为它们的协调诱导可能是受精准的转录调控。尿素循环基因具有共同的调节元件，如CREs(cAMP response elements, cAMP反应元件)和GREs(Glucocorticoid-responseelements, 糖皮质激素反应元件)。值得注意的是，在Opa1^tg白色前脂肪细胞的米色化过程中，CREB被预测是一个重要的上游调节因子(图S4B)。cAMP和钙调节蛋白激酶的多个信号通路可以磷酸化和激活CREB。GO分析显示，在Opa1^tg白色前脂肪细胞上调的基因中，有许多基因与cAMP信号通路和离子通道功能显著相关，这说明过表达Opa1可能通过调节Ca²⁺水平来控制尿素循环基因的表达。然而，在WT和Opa1^tg前脂肪细胞中，测得的胞质Ca²⁺水平是相近的。这一结果排除了Opa1通过增加细胞内Ca²⁺水平来控制尿素循环酶表达的可能性(图7A)。在代谢组学分析中，作者无法区分Opa1^tg前脂肪细胞中cAMP和总单磷酸腺苷(AMP)水平的升高 (图7A)。值得注意的是，能量电荷[(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)]不受Opa1过表达的影响。因此假设观察到的AMP的增加是由于cAMP的升高。在新鲜制备的Opa1^tg 小鼠SAT前脂肪细胞中，cAMP浓度确实总是高于对应的WT细胞(图7B)。这些数据表明CREB可能在组织诱导Opa1^tg前脂肪细胞中尿素循环酶的作用。作者进一步检测发现，Opa1^tg前脂肪细胞中CREB被激活且磷酸化水平显著提高，CPS1和ASL水平也更高(图7C)。为了研究CREB持续性激活是否与诱导Opa1^tg前脂肪细胞中尿素循环酶CPS1和ASL上调有关，作者使用CREB的特异性抑制剂666-15进行处理。与预期结果一致，666-15减少了CREB磷酸化，更重要的是，将Opa1^tg前脂肪细胞中的CPS1和ASL的表达水平降低到了WT水平(图7C)。稳态代谢组学表明，666-15减少了Opa1^tg前脂肪细胞典型的延胡索酸积累(图7D)。同时，抑制CREB降低了Opa1^tg的棕色化，但对WT前脂肪细胞没有影响(图7E)。总之，这些数据表明cAMP/CREB与Opa1诱导尿素循环酶和脂肪细胞棕色化有关。

拓展阅读

尿素循环

尿素循环又名鸟氨酸循环，是指氨基酸在体内代谢产生的氨，经过鸟氨酸合成尿素的过程。其功能是将有毒的氨转变为无毒的尿素，从而避免高氨血症的发生。

该循环主要在肝脏的线粒体和胞质中进行，共分为五个步骤。首先，在线粒体氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(Carbamoyl phosphate synthetase I,CPS1)作用下，催化1分子NH₃和1分子CO₂生成氨甲酰磷酸，该步骤是尿素循环的关键步骤和限速步骤。随后，在鸟氨酸氨基甲酰转移酶(Ornithine-transcarbamylase, OTC)作用下，将其进行拆分，将其中的甲酰基和氨基转移到鸟氨酸上形成瓜氨酸。然后，瓜氨酸离开线粒体，在胞质中的精氨基琥珀酸合成酶(Arginino-succinate synthetase, ASS)作用下，与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，并在精氨酸代琥珀酸裂解酶(Arginino-succinatelyase, ASL)的作用下裂解为精氨酸和延胡索酸。精氨酸进一步被精氨酸酶分解形成尿素和鸟氨酸，并释放出一分子水。尿素被体内代谢排出，而鸟氨酸则可以重新回到线粒体里，和氨基甲酰磷酸生成瓜氨酸，参与下一轮循环。

研究表明，蛋白质摄入或内源性蛋白质分解代谢引起的氨基酸氮通量的变化能够影响尿素循环酶活性。根据细胞内能量状态控制氮源影响尿素合成的酶主要有三种：谷氨酰胺分解酶（Glutaminase, GLS）、谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase, GDH)以及CPS1。谷氨酰胺在谷氨酰胺分解酶的作用下生成谷氨酸和NH₃，NH₃可以作为尿素循环的氮源，同时该反应受到细胞内氨浓度、ADP及磷酸水平的调节。GDH则与高胰岛素血症和高氨血症密切相关，其胺化作用主要用于维持细胞内氨稳态。而CPS1作为尿素循环的原料供应酶、起始酶和限速酶，可以调控尿素循环的开关和速率。其增强子具有多种结合位点，因此受到多种物质的共同调控，同时还受到别构激活剂N-乙酰谷氨酸的调节。还有研究表明，在非小细胞肺癌中发生的肝激酶(Liver kinase B1, LKB1)突变可以通过激活AMPK通路抑制CPS1的转录，引起癌细胞中的尿素循环异常。

参考文献：

[1] Morris SM Jr et al.Annu Rev Nutr. 2002;22:87-105.

[2] Takiguchi M, Mori M. BiochemJ. 1995 Dec 15;312:649-59.

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-021-00497-2

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