编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

听说过“死亡四重奏”吗？在“快乐肥宅”生活方式的影响下，肥胖、高血糖、高血脂和高血压等代谢疾病日益增加，使得人们越发关注对以糖脂代谢紊乱为中心的代谢综合征的研究。葡萄糖稳态平衡主要由骨骼肌、心脏和脂肪组织摄取的葡萄糖和由肝脏、肾和肠道产生的葡萄糖来共同维持。已有研究表明，人体内棕色或米色脂肪的激活会增加基础的和胰岛素刺激下的全身葡萄糖利用，这表明脂肪组织在葡萄糖调节中具有重要的生理作用。

越来越多的证据表明，产热脂肪组织可以通过分泌因子介导有益的代谢作用，但其潜在机制尚不清楚。目前，已经鉴定了一些调控葡萄糖代谢的自分泌或旁分泌因子，包括FGF21(fibroblast growth factor 21, 成纤维细胞生长因子21)、IL-6（Interleukin-6，白细胞介素-6）、Slit2-C(SlitGuidance Ligand 2-C, 狭缝导向配体2-C)和Neuregulin 4（神经调节因子4）（小编注：这四个因子中，FGF21和IL-6是胰岛素非依赖型调控血糖的因子，但Slit2-C和Neuregulin 4未见明确的分类）。研究指出，增加脂肪组织葡萄糖摄取有两种途径：合成代谢过程（anabolic processes）中胰岛素依赖性葡萄糖摄取和产热过程中由FGF21或去甲肾上腺素等分子介导的胰岛素非依赖性葡萄糖摄取。然而，胰岛素具有促进脂质生成的作用，能够推动非酒精性脂肪肝的发生。目前的胰岛素疗法和使用胰岛素增敏剂常伴有不良反应，如肝脏脂质生成增加。因此，寻找和研究胰岛素非依赖的葡萄糖调控因子，从而在增加外周葡萄糖摄取的同时不对肝脏脂质累积产生负面影响的治疗方法将有利于更全面的改善代谢综合征。同时，有研究发现缺乏米色脂肪组织的小鼠肝脏脂肪变性加剧，这表明可能存在调节脂质累积的脂肪来源的旁分泌因子。

本研究中，作者发现分泌蛋白Isthmin-1(Ism1)具有不寻常的双重代谢作用。Ism1最初被发现在非洲爪蟾的中脑-后脑组织（midbrain-hindbrain organizer）中表达，称为isthmus，其在早期大脑发育中发挥作用。Ism1基因在小鼠和人类中是保守的。在新生和成年小鼠中，ISM1在肺和脑中显著表达，主要存在于支气管和肺泡的上皮以及大脑皮层、小脑和海马中。人类ISM1被发现可以在皮肤、粘膜组织和一些淋巴细胞群中表达，人或小鼠CD4+ T细胞激活时可以识别表达ISM1。因而在哺乳动物中，ISM1可能与免疫系统有关，但在成人中的生理功能尚不清楚。（小编注：这里的分泌细胞主要是根据人类基因表达数据库分析得出的。表达组织类型是根据小鼠从早期胚胎阶段到成年阶段比较得出的ISM1分布上的差异。）目前，ISM1的研究主要集中在其抗血管生成、抗肿瘤生成和促凋亡等功能上。本文作者通过遗传模型和药理学方法证明，Ism1是一种由脂肪细胞分泌的信号多肽因子，既能以自分泌方式作用于脂肪细胞，又能以内分泌方式作用于肝脏细胞，在调节葡萄糖摄取的同时可以抑制脂质累积。因此，Ism1是一种具有生物活性的多肽类激素，它为葡萄糖和脂质相关疾病提供了新的治疗途径。

产热脂肪组织的激活与代谢健康的改善有关，但来源产热脂肪细胞的分泌因子仍有待研究。为了鉴定具有激素样特性的脂肪组织衍生蛋白，作者对棕色和白色成熟脂肪细胞的RNA测序结果进行生物信息学分析。首先，作者利用来自ucp1-TRAP小鼠腹股沟(iWAT)、附睾(eWAT)和棕色脂肪(BAT)分离出的成熟脂肪细胞的RNA测序数据集并应用分泌预测软件SignalP进行分析，预测出512个分泌蛋白。在此基础上，为了只筛选通过经典分泌途径分泌的分泌蛋白，作者对小鼠原代脂肪细胞（来源“beiged”ap2-PRDM16小鼠的iWAT、eWAT和BAT）的TMT复合蛋白质组分泌体（the TMT multiplexed proteomic secretome）中的多肽进行了基因筛选并列出属于经典分泌蛋白并具有类激素性质的16种蛋白质 (图S1A；表S1)。LC-MS(liquid chromatography-tandem massspectrometry，液相色谱-串联质谱)结果显示在培养的脂肪细胞的培养基中存在Ism1蛋白上的2个特异性肽段，且该蛋白是脂肪细胞中平均肽强度(peptide intensity)为150的分泌因子(图1A和1B)。脂联素-TRAP小鼠的RNA测序结果显示，与iWAT和eWAT相比，Ism1在成熟棕色脂肪细胞中高度富集，且在BAT中的表达高于iWAT(图S1A和S1B)。此外，Ism1在“beiged”ap2-PRDM16小鼠iWAT中表达更高，并在受到冷刺激时，在iWAT中升高更为显著(图S1C-F)。再者，对分离的成熟脂肪细胞的RNA和蛋白质分析表明，Ism1在成熟脂肪细胞中大量表达，而在SVF中表达极低。且Ism1、Adipoq和Pparg的表达特征相似，在分化过程中Ism1的表达也大幅上调(图1C-E)。

拓展阅读

调控葡萄糖代谢的分泌因子

FGF21：FGF21以非胰岛素依赖的方式刺激脂肪细胞中葡萄糖摄取，其通过激活GLUT1 mRNA表达，上调质膜上的GLUT1表达水平，并促进脂肪细胞进行葡萄糖摄取。也有研究表明脂联素是FGF21的下游效应因子。FGF21可增强脂肪细胞中脂联素的表达和分泌，从而提高小鼠血清脂联素水平。

IL-6：研究指出，在脂肪组织中，IL-6水平增加具有改善血糖的代谢益处。其可促进GLP-1的产生，从而增加胰岛素的分泌。在中枢神经系统（CNS）中的IL-6信号可抑制进食并改善血糖调节，减轻全身炎症，并改善瘦（lean）和胖（obese）小鼠巨噬细胞和肝细胞的血糖水平。

Slit2-C：Slit2是一种由Prdm16调节并由米色脂肪细胞分泌的蛋白质。Slit2在翻译后被切割成几个小片段，其中Slit2-C片段在血浆中可激活脂肪细胞的产热PKA依赖途径，并改善饮食诱导肥胖小鼠的葡萄糖稳态。

Neuregulin 4：神经调节蛋白4（Nrg4）在脂肪组织中高度表达。Nrg4通过减弱肝脏脂肪生成信号传导，对饮食诱导的胰岛素抵抗和肝脂肪变性具有保护作用。在机制上，Nrg4激活肝细胞中的ErbB3和ErbB4信号，并以细胞自主的方式负调LXR和SREBP1c介导的脂肪从头生成。

拓展阅读

蛋白分泌途径知多少

大多数分泌蛋白通过经典的内质网/高尔基体途径进行运输，被称为经典分泌蛋白。这些蛋白依赖于三个主要的经典分泌途径:一般分泌途径(Sec依赖途径)、双精氨酸易位途径(Tat依赖途径)和信号识别粒子途径(Srp途径)。Sec分泌系统是将未展开的蛋白质通过细胞质膜转运的主要分泌系统。该系统依赖于信号肽以确定正确的蛋白转运复合物目标。Tat途径通过识别相应Tat依赖底物的n端信号序列，将折叠蛋白通过细胞质膜运输。Srp途径是一种共转译分子机制，Srp基于疏水信号序列(Nterminal可剪切的信号肽或跨膜段)识别和靶向核糖体-新生链复合物到各自目的膜上的蛋白质转运通道。

此外，在细胞外环境中有许多没有可预测或已知信号序列的细胞质蛋白，这些蛋白被归类为非经典分泌蛋白(如GAPDH)，它们具有以下共同特点：在游离核糖体上合成；没有有功能的信号肽；没有依赖于内质网/高尔基体的翻译后修饰；分泌依赖能量和温度，并在多种条件下被抑制或激活，是可调控的。）

本文聚焦在经典途径的理由，推测是绝大多数的分泌蛋白是通过经典途径分泌的，在代谢活动中也起到主要作用；而非经典分泌蛋白目前的研究和其潜在机制还不是很清楚。

拓展阅读

探索蛋白修饰

LC-MS/MS(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 液相色谱-串联质谱)是将高效液相色谱的高分离度与质谱的高选择性、高灵敏度结合的技术。目前，LC-MS/MS已用于多种蛋白修饰位点的检测（如乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化等）。蛋白质的糖基化或者磷酸化修饰属于蛋白质翻译后修饰，即蛋白质氨基酸序列的特定位置可以与化学基团或者小分子量的蛋白共价结合，从而导致特定序列分子量的变化，而质谱分析可以通过串级碎裂找到发生差异的位置从而根据质荷比来判断不同的修饰位点。

为了检测Ism1的代谢功能，作者在哺乳动物HEK 293 Expi细胞（小编注：一种基于HEK293细胞的细胞表达系统，主要用于高效获取293来源的重组蛋白。）中制备了带有C-末端myc-his标签的小鼠Ism1重组蛋白并进行纯化。SDS凝胶电泳分析表明，单一纯化的成熟蛋白分子量约为60~65kDa，使用Ism1抗体验证了该蛋白与市售的小鼠Ism1重组蛋白相似(图1F，图S1G)。当使用包括PNGase F(Peptide N Glycosidase F, N-糖酰胺酶F)在内的去糖基化酶处理后，蛋白条带从65kDa移至60kDa，表明Ism1是N-糖基化蛋白(图1F)。同时，利用LC-MS/MS检测发现Ism1蛋白的N-端存在多个N-连接的糖链，并揭示了Ism1蛋白上新的糖基化和磷酸化位点 (表S2)。在自然条件下，SEC(Size exclusion chromatography, 排阻色谱又名凝胶渗透色谱)分离结果显示Ism1蛋白可洗脱为单峰，但也可能形成二聚体或寡聚体(图1G)。接着，通过LC-MS/MS对整体蛋白分析表明，Ism1蛋白纯度很高，不含其他蛋白污染物(图1H；表S3)。更重要的是，作者检测了该纯化蛋白质的内毒素水平低于0.1EU/mL(图S1H)。当蛋白质在37℃孵育长达200h时，蛋白质聚集实验显示Ism1蛋白透光率没有随时间而增加，表明其稳定性并未受损(图S1I)。这些数据证实了高纯度Ism1重组蛋白可用于体外和体内研究。

脂肪组织的重要功能包括葡萄糖和脂肪酸摄取、Ucp1依赖性解偶联呼吸、线粒体生物合成以及无效肌酸循环和ATP依赖性钙离子循环。为了探究Ism1在产热过程中的潜在作用，作者首先使用载体或Ism1蛋白（50-200nM）处理原代小鼠脂肪细胞24h，尽管cAMP激活剂forskolin可以诱导Ucp1表达，但Ism1处理并没有促进效果(图S1J)。同样，Ism1处理对调节替代产热途径的基因表达也没有影响，包括无效肌酸循环(Crt、Gatm、Gamt和Ckmt1)、ATP依赖性钙离子循环(Serca2b)或Ucp1非依赖的解偶联产热途径(Pm20d1，一种内源性解偶联物的酶) (图S1K)。（PM20D1是一种双向酶，可以催化氨基酸和游离脂肪酸生成N-酰基氨基酸，也可以逆向反应生成氨基酸和游离脂肪酸，而N-酰基氨基酸则以不依赖 UCP1 的方式作为线粒体呼吸的内源性解偶联剂发挥作用。（1）通过ATP 合酶抑制剂寡霉素阻断耦合呼吸，并用N-酰基氨基酸给药后，UCP1的 WT 和 KO 鼠中非偶联呼吸增加程度一致。此外，以同样方式诱导UCP1-KO小鼠的成肌细胞系C2C12和人骨肉瘤细胞系 U2OS，结果依然存在，表明PM20D1/ N-酰基氨基酸是以UCP1非依赖性的方式发挥作用。（2）分离BAT的线粒体并单独给药，发现线粒体呈现出剂量依赖性呼吸增加，并不需要其他细胞成分。此外，TMRM检测活细胞膜电位发现，给药后可以直接增强分离线粒体中的非偶联呼吸，逆转寡霉素引起的膜电位升高。还有研究表明，脂肪酸酰胺水解酶 (FAAH) 也可以作为N-酰基氨基酸合酶/水解酶调控其活性。在PM20D1-KO小鼠肝脏中，丝氨酸水解酶抑制剂 MAFP和FAAH特异性抑制剂PF-3845可以明显抑制C20:4-Gly的水解活性。且与PM20D1不同， FAAH的底物选择部分重叠，但范围更小。目前仅发现FAAH转染的细胞对四种N-酰基氨基酸—C18:1-Gly、C18:1-Ser、C20:4-Gly 和 C20:4-Ser表现出水解活性。此外，与PM20D1作为细胞外的调控因子在血浆中广泛存在不同，FAAH几乎完全定位于细胞内。此外，Ism1也不能增加基础呼吸率、去甲肾上腺素诱导的细胞呼吸率或最大呼吸率(图S1L)。最后，通过测定甘油发现Ism1和胰岛素均轻微抑制了脂质分解(图S1M)。这些结果表明，Ism1不能急性诱导脂肪细胞的产热、脂解和细胞耗氧。

拓展阅读

Ucp1非依赖的解偶联产热途径

在Ucp1非依赖性的解偶联产热途径中，N-酰基氨基酸起到了重要的作用。目前已发现PM20D1是N-酰基氨基酸的重要调节酶。PM20D1是一种双向酶，可以催化氨基酸和游离脂肪酸生成N-酰基氨基酸，也可以逆向反应生成氨基酸和游离脂肪酸，而N-酰基氨基酸则以不依赖 UCP1 的方式作为线粒体呼吸的内源性解偶联剂发挥作用。研究表明，通过ATP 合酶抑制剂寡霉素阻断耦合呼吸，并用N-酰基氨基酸给药后，UCP1的 WT 和 KO 鼠中非偶联呼吸增加程度一致。此外，以同样方式诱导UCP1-KO小鼠的成肌细胞系C2C12和人骨肉瘤细胞系 U2OS，结果依然存在，表明PM20D1/ N-酰基氨基酸是以UCP1非依赖性的方式发挥作用。在分离BAT的线粒体并单独给药后，发现线粒体呈现出剂量依赖性呼吸增加，并不需要其他细胞成分。此外，TMRM检测活细胞膜电位发现，给药后可以直接增强分离线粒体中的非偶联呼吸，逆转寡霉素引起的膜电位升高。

除PM20D1外，脂肪酸酰胺水解酶 (FAAH) 也可以作为N-酰基氨基酸合酶/水解酶调控其活性。在PM20D1-KO小鼠肝脏中，丝氨酸水解酶抑制剂 MAFP和FAAH特异性抑制剂PF-3845可以明显抑制C20:4-Gly的水解活性。且与PM20D1不同， FAAH的底物选择部分重叠，但范围更小。目前仅发现FAAH转染的细胞对四种N-酰基氨基酸—C18:1-Gly、C18:1-Ser、C20:4-Gly 和 C20:4-Ser表现出水解活性。此外，与PM20D1作为细胞外的调控因子在血浆中广泛存在不同，FAAH几乎完全定位于细胞内。

由于脂肪组织在葡萄糖调节中起着重要作用，占总葡萄糖摄取的10%-15%，因此，作者接下来探究Ism1是否会增加脂肪细胞对葡萄糖的摄取。在使用[³H]-2-脱氧葡萄糖检测葡萄糖摄取之前，用10-200nM的Ism1或胰岛素处理人类SGBS脂肪细胞（小编注：人Simpson-Golabi-Behmel syndrome综合征患者的前体脂肪细胞，其与来自人类皮下脂肪的体外成熟脂肪细胞相当。），结果发现胰岛素从20nM开始诱导增加SGBS细胞的葡萄糖摄取(图1I)。此外，与胰岛素的结果类似，Ism1也从20nM开始诱导增加SGBS细胞的葡萄糖摄取，使其增加为1.5倍(图1I)。除了人SGBS脂肪细胞外，100nM的Ism1还可以增加小鼠原代脂肪细胞的葡萄糖摄取(图1J)。值得注意的是，Ism1提升葡萄糖摄取的作用是在胰岛素缺乏情况下出现的。虽然胰岛素诱导的葡萄糖摄取比Ism1诱导要高，但在用50nM胰岛素处理的细胞中添加100nM Ism1可以进一步增强胰岛素的诱导作用(图1K)。此外，长时间的Ism1处理不会导致脱敏现象，因为Ism1处理24h与4h诱导的葡萄糖摄取程度相似(图S1N)。100nM白蛋白作为蛋白对照对葡萄糖摄取没有影响，这表明Ism1具有特定的生物活性(图S1N)。

Ism1对葡萄糖摄取的诱导作用并不局限于脂肪细胞。在人原代骨骼肌细胞（小编注：primaryhuman skeletal muscle cells，CookMyocytes, Cat#SK-1111）中的实验结果显示，与对照细胞相比，50nM和200nM的Ism1诱导葡萄糖摄取分别提升5倍和7倍(图1L)。然而Ism1不能诱导分化的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，而胰岛素在该细胞系中可以诱导将近40倍，这表明Ism1的作用依赖于细胞类型特异性受体（cell-type-specific receptors）或葡萄糖转运蛋白(图S1O)。这些结果表明，Ism1诱导的葡萄糖摄取具有细胞类型依赖性，其可能作用于低丰度的细胞表面受体。（小编注：作者使用了四种不同细胞类型的细胞研究显示，Ism1诱导葡萄糖摄取1.25倍至6倍。Ism1在原代小鼠脂肪细胞中的作用小于胰岛素的50%（图1K），在SGBS细胞中的作用为50%-100%（图1I和4H），在人类骨骼肌细胞中的作用为70%（图1L）。因此作者推测Ism1存在特异性受体，受体的丰度也受细胞类型的影响，可能不高。）

GLUT4（葡萄糖转运蛋白4）是脂肪组织中主要的胰岛素敏感转运蛋白，在非刺激条件下，它被分隔在细胞内囊泡中。当胰岛素刺激对胰岛素敏感的组织时，GLUT4被转运到细胞表面以增加葡萄糖摄入。为了检测Ism1是否促进GLUT4向质膜转运，作者用100nM的胰岛素或Ism1处理细胞，然后进行Glut4免疫染色和共聚焦显微镜观察发现，与对照细胞相比，Ism1和胰岛素处理均能诱导细胞表面Glut4水平升高，这表明Glut4是被分隔在细胞内的 (图1M)。将质膜与细胞质组分分离后发现，Ism1和胰岛素刺激Glut4向质膜移位，而在对照处理下则没有移位(图1N)。这些结果表明，Ism1至少部分是通过促进GLUT4转运到细胞表面来增加脂肪细胞的葡萄糖摄取。

受Ism1调节葡萄糖转运的外源性作用的启发，作者接下来想确定内源性Ism1是否足以调节葡萄糖摄取。为此，作者构建了小鼠Ism1的shRNA腺病毒，急性Ism1敲低实验结果显示，可实现50%和70%的敲低效率而不影响脂肪细胞的分化进程（脂联素基因表达无变化）(图1O)。同时，Ism1敲低可抑制脂肪细胞的葡萄糖摄取，这表明内源性的Ism1水平有助于脂肪细胞的基础葡萄糖摄取(图1P)。

因为葡萄糖摄取涉及1A型PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶)调节亚基的激活和AKT S473位点的磷酸化，作者接下来检测了在敲低Ism1的细胞中pAKT^S473的磷酸化水平。与对照组LacZ-shRNA相比，Ism1-shRNA脂肪细胞中的pAKT信号通路降低了20%-50%，这表明内源性Ism1是维持AKT本底信号强度所必需的(图1Q和1R)。而且Ism1对胰岛素依赖性的葡萄糖摄取也很重要，与对照细胞相比，即使在最大胰岛素浓度下，Ism1水平下降的细胞也难以对胰岛素诱导的葡萄糖摄取做出反应，并伴随着pAKT水平下降 (图1S-U)。综上所述，这些数据表明Ism1作为一种分泌因子，可以在体外通过外源性和内源性形式调节葡萄糖摄取。

拓展阅读

神奇的小鼠模型

TRAP（Translating Ribosome Affinity Purification，翻译核糖体亲和纯化）是利用在特定细胞类型中表达的 GFP 标记的核糖体蛋白，从而允许在不分离组织的情况下，从复杂组织中的靶细胞中分离出核糖体结合的mRNA。UCP1-TRAP小鼠可以通过TRAP技术，在小鼠中鉴别UCP1阳性细胞。TRAP小鼠可以表达融合蛋白eGFP和敲入Rosa26位点的lox-stop-lox盒下游的60S核糖体亚基L10a，其C端连接亲和标签eGFP，当与UCP1-Cre小鼠杂交后，产生的后代即UCP1-TRAP小鼠。因此，在表达Ucp1-Cre的细胞中，eGFP-L10a具有较高表达水平，从而鉴别出UCP1阳性细胞。

UCP1-TRAP小鼠

脂联素-TRAP小鼠同样是通过TRAP 方法构建获得，TRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素Cre小鼠 (Ad-Cre) 杂交，其后代eGFP-L10a在棕色脂肪组织和白色脂肪组织中表达，使得脂肪细胞被特异性标记。

由于PRDM16 通常在分化前的脂肪祖细胞和BAT中表达较高，而在iWAT中基本不表达。因而ap2-PRDM16小鼠就利用其iWAT中有更多的米色脂肪细胞，且aP2在脂肪细胞分化过程中活跃的特点，在iWAT中表达PRDM16。与WT小鼠相比，来自aP2-PRDM16的iWAT中UCP1、Cidea(Cell death-inducing DFFA-like effector A, 细胞死亡诱导DFFA样效应器A)、Cpt1b(Carnitine palmitoyltransferase 1B, 肉毒碱棕榈酰基转移酶1B)和Otop1(Otopetrin-1, 耳蝶呤1)的mRNA水平分别增加了50、20、10和20倍。此外，PGC-1α、Cox7a1(Cytochrome C Oxidase Subunit 7A1, 细胞色素C氧化酶亚基7A1)和Ntrk3(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 3, 神经营养受体酪氨酸激酶3)也通过PRDM16的转基因表达显著升高。

参考文献：

[1] Long JZ et al.  Cell Metab. 2014 May 6;19(5):810-20. 

[2] Kajimura S et al.Nature. 2009 Aug27;460(7259):1154-8.

图1.Ism1是一种脂肪因子，在人和小鼠脂肪细胞中诱导葡萄糖摄取

图S1.Ism1是一种脂肪因子，在人和小鼠脂肪细胞中诱导葡萄糖摄取

在代谢功能紊乱个体中许多代谢激素因子会升高，包括胰岛素、FGF21、FGF1和GDF15。因此，作者继续探究Ism1水平是否会因营养和肥胖状况而变化。在给小鼠喂食高脂肪食物(HFD)16周后，发现与瘦小鼠（ND）相比，HFD小鼠的iWAT和BAT中瘦素水平分别增加了近20倍和5倍；在HFD小鼠iWAT中Ism1基因表达平均增加了30倍，而在BAT中没有差异(图S2A和S2B)。为了检测肥胖人群的脂肪组织中Ism1的表达是否受影响，作者收集了43个临床代谢参数已知的人的皮下成熟脂肪细胞并检测Ism1表达水平。在该数据集中，Ism1表达与BMI(body mass index，体重指数)呈显著正相关(图S2C)。当基于体重、胰岛素或葡萄糖水平参数对个体进行分组时，在BMI>28的个体中Ism1表达较高(图S2D)。然而在这些个体中，Ism1转录水平与葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR或游离脂肪酸水平没有显著相关性(图S2E-S2J)。重要的是，通过使用ISM1单克隆抗体，作者观察到在女性个体中，血浆中ISM1平均水平为50pg/mL，且与BMI呈正相关趋势，但与葡萄糖不呈正相关(图S2K和S2L)。这些结果表明在小鼠和人体内，ISM1是一种真正的激素，其循环水平受营养和代谢变化的生理调节。

图S2.在小鼠和人类中，ISM1的表达与肥胖有关

由于上文发现Ism1在体外可以通过外源性和内源性控制葡萄糖摄取，作者接下来尝试通过Ism1基因靶向敲除的小鼠来研究Ism1内源性的生理功能。首先，作者利用CRISPR介导的基因编辑技术制备了跨越外显子2-4的Ism1-floxed等位基因。其次，将Ism1-floxed等位基因与表达Ella-Cre转基因的雌性小鼠杂交(图S3A和S3B) （小编注：EIIa-cre小鼠在腺病毒EIIa启动子的控制下携带cre转基因，该基因以cre重组酶在小鼠早期胚胎中的表达为目标，可用于loxP侧链基因的生殖系缺失。）。通过qPCR检测证实了与WT小鼠相比，Ism1-KO小鼠iWAT、eWAT和BAT中Ism1的mRNA表达缺失(图2A)。研究发现，Ism1在WT小鼠血清中的浓度约2-4pg/mL，而在Ism1-KO小鼠中并未检测到(图2B)。值得注意的是，在普通饮食下，WT与Ism1-KO组小鼠的体温、食物摄入量、胰岛素水平和体重没有明显差异(图2C-F)，但Ism1-KO小鼠的胰岛素抵抗有增加趋势，葡萄糖耐量则显著降低(图2G和2H)。这些结果表明Ism1可调节外周葡萄糖摄取。接着，为了验证Ism1敲除是否导致了组织葡萄糖摄取减少，作者在三种饮食条件，即普通饮食（NCD）、高脂饮食（HFD）或非酒精性脂肪肝饮食(NAFLD)（小编注：作者使用D09100310饲料进行诱导，该类饲料主要用于诱导非酒精性脂肪肝炎，其主要成分为40 kcal%脂肪（主要是棕榈油）、20 kcal%果糖和2 kcal%胆固醇。)喂养4周后，分别对WT与Ism1-KO组小鼠进行[3H]-2-脱氧葡萄糖放射性标记示踪。结果发现，在三种饮食条件下，Ism1-KO小鼠的BAT葡萄糖摄取均降低，但只有在NCD条件下才有显著差异。在NAFLD条件下，Ism1-KO小鼠骨骼肌的葡萄糖摄取也降低，而在iWAT和肝脏中二者没有显著差异。HFD条件下，WT与Ism1-KO小鼠的骨骼肌糖摄取无差异；KO的iWAT、BAT（p=0.07）和肝脏糖摄取降低，但无显著差异 (图2I)。此外，基础的和胰岛素诱导的组织特异性葡萄糖摄取分析显示Ism1-KO小鼠BAT组的葡萄糖摄取对比WT小鼠下降最为明显 (图2J和S3E)。上述数据表明Ism1-KO小鼠的糖耐量降低可能是由于BAT和骨骼肌的基础葡萄糖摄取受损以及BAT胰岛素敏感性降低的综合作用所致。此外，将Ism1重组蛋白注射到Ism1-KO小鼠体内可以增加BAT和骨骼肌的葡萄糖摄取(图2K)，这表明葡萄糖摄取变化的表型是由Ism1缺乏直接引起的，而非继发性的。总之，这些数据揭示了BAT和骨骼肌是负责Ism1介导葡萄糖摄取的主要代谢组织。

紧接着，为了确定Ism1在脂肪细胞葡萄糖摄取时起到的作用，作者从WT和Ism1-KO小鼠中分离出原代小鼠腹股沟脂肪细胞，并在体外分化成成熟脂肪细胞。从脂联素表达水平和油红O染色结果可以看出，WT和Ism1-KO细胞的分化能力无显著差异；内源性Ism1在原代脂肪细胞中含量较高，而在Ism1-KO细胞中则不表达(图2L和2M)。作者还观察到与WT细胞相比，Ism1-KO脂肪细胞中pAKT水平显著降低，这进一步证实了脂肪细胞分泌的内源性Ism1参与基础信号转导(图2N和2O)。最后，Ism1敲除导致胰岛素诱导的信号转导和葡萄糖摄取下降(图2P和2Q)。这些结果表明Ism1可调节小鼠脂肪细胞中一部分的外周血糖调节和全身葡萄糖摄取。

图2.敲除ISM1导致糖耐量下降和脂肪细胞的葡萄糖摄取受损

图S3.敲除ISM1导致糖耐量下降和脂肪细胞的葡萄糖摄取受损

因为许多激素和生长因子是细胞表面受体的高亲和力配体，所以作者想要进一步确定介导Ism1功能的胞内信号通路。基因家族树分析表明，Ism1与其他含有TSP1(Thrombospondin type 1, 凝血酶敏感蛋白1型)结构域或AMOP(Adhesion-associated domain, 黏附相关结构域)的蛋白是远亲关系(图S4A)。然而，这两个结构域都不具有任何直接的信号活性。于是，作者分别用载体蛋白或Ism1蛋白处理3T3-F442A细胞5分钟后，检测了43种特异性蛋白的磷酸化水平。结果显示响应Ism1处理最显著的是磷酸化AKT/PKB (Phosphorylated protein kinase B, 蛋白激酶B) （S473） (图3A)。为了证实蛋白质阵列结果的特异性，上述AKT信号反应是特异性针对Ism1蛋白而不是重组蛋白质C-末端标签引起的非特异反应，作者使用了一种AKT^S473磷酸化特异性抗体和带有C-末端FLAG标签或C-末端His标签的Ism1蛋白进行实验。结果发现胰岛素和两种Ism1蛋白在促进pAKT^S473磷酸化水平上表现出相似的生物活性(图3B)。除了3T3-F442A以外，Ism1还能够在分化的小鼠原代棕色脂肪细胞、原代白色脂肪细胞、人SGBS脂肪细胞、C2C12骨骼肌细胞和人原代骨骼肌细胞(HSMCs)中诱导pAKT^S473磷酸化水平(图3C-F，S4B和S4C)，这与Ism1诱导脂肪细胞和骨骼肌细胞摄取葡萄糖的功能一致。同时，为了确定Ism1诱导pAKT^S473信号通路所需的最小剂量，作者在3T3-F442A细胞中进行了剂量依赖实验。结果显示Ism1和胰岛素分别从50nM和10nM开始诱导pAKT^S473磷酸化水平，并呈剂量依赖性增加(图3G)。然后对pAKT^S473进行定量分析显示，100nM的Ism1与10nM胰岛素的诱导程度大致相似 (图3H)。

拓展阅读

3T3-L1和3T3-F442A傻傻分不清？

3T3-L1和3T3-F442A都是3T3细胞的亚系。成纤维细胞3T3-L1是来源于鼠的前体脂肪细胞的细胞株，具有定向分化为成熟脂肪细胞的特性，能充分显示在体细胞的特点，包括形态学改变、多种脂肪代谢酶的表达、广泛的脂质积聚等，是体外研究脂肪细胞的理想实验细胞模型。3T3-F442A在脂肪分化和代谢的研究中也发挥了重要作用，在适当的培养条件下，将3T3-F442A细胞植入胸腺小鼠皮下时，在不添加外源诱导物的情况下也可以形成正常脂肪组织。但3T3-L1和3T3-F442A在分化和代谢方面存在一些差异。例如，当将3T3-F442A前脂肪细胞注射到裸鼠皮下时，它们会对身体生理信号做出反应，并分化成脂肪垫。与体内脂肪组织相比，由3T3-F442A前脂肪细胞衍生的皮下脂肪垫表达的瘦素水平与附睾脂肪组织中发现的瘦素水平相似。此外，3T3-F442A细胞可以分化为成骨细胞，3T3-L1细胞可分化为巨噬细胞，这表明这两个克隆亚系具有可塑性。

有意思的是，在本文中，作者发现3T3-L1对Ism1处理没有反应，但3T3-F442A却对Ism1具有良好的反应性。

胰岛素可诱导pAKT^S473和pAKT^T308的磷酸化，这两者与不同组织中葡萄糖的摄取都有关系。为了探究Ism1对时间信号（thetemporal signaling）的响应，作者对Ism1、胰岛素或Pdgf-ββ(Platelet-derived growth factor-ββ, 血小板衍生生长因子-ββ)进行了时间进程实验，结果显示在100nM的Ism1或胰岛素处理的细胞中，pAKT^T308在所有时间点均发生磷酸化(图3I)。值得注意的是，在100nM时，Ism1并不像已知的有丝分裂原Pdgf-ββ那样引起剧烈的ERK1/2磷酸化（小编注：PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK和AMPK/MEK/ERK通路均因在肝癌细胞等细胞的存活、生长和代谢中起着重要作用而被广泛研究。另外，下面提到的PKA可以通过对Raf1的磷酸化抑制Raf1的激活，阻断Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的激活，抑制细胞的增殖；AMPK和GSK3等胰岛素非依赖性激酶可以磷酸化IRS从而对通路进行调控，而PDK1可以通过胰岛素激活调控Akt通路）。然而，在200nM时，Ism1表现出比胰岛素更持久和更强效的ERK1/2磷酸化，这表明Ism1和胰岛素诱导不同的信号反应和下游通路(图S4E)。此外，即使在200nM剂量下，Ism1在PKA(Proteinkinase A, 蛋白激酶A)、PDK1或GSK3β等其他途径上也没有任何活性或仅有弱活性(图S4E)。

基于此，为了进一步详细地研究Ism1信号通路，作者用四种靶向PI3K通路的抑制剂预处理3T3-F442A细胞：Wortmannin(渥曼青霉素)、LY294002、PIK或Omipalisib(奥米帕利西，双PI3K-mTOR抑制剂)，发现这四种抑制剂都能完全阻断Ism1和胰岛素诱导的pAKT^S473磷酸化(图4A)。在脂肪细胞中也有相同的反应，LY294002和Wortmannin抑制了Ism1诱导的原代脂肪细胞pAKT^S473活性(图S4F)。结果显示，PI3K在脂肪细胞的葡萄糖调节中是必需的，因为加入抑制剂后Ism1诱导的葡萄糖摄取被完全阻断 (图4B)。由于胰岛素信号元件如IRS-1(insulinreceptor substrate，胰岛素受体底物)和IGF1R（insulin-like growth factor 1 receptors，胰岛素样生长因子1受体）/IR（insulin receptors，胰岛素受体）受哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）—mTORC1和mTORC2的多蛋白复合物的严格调控，且这两个mTOR复合物均能被胰岛素激活。于是为了研究mTORC1复合物是否参与Ism1信号转导，在Ism1或胰岛素刺激之前，作者先用mTORC1抑制剂雷帕霉素或mTORC2抑制剂Torin处理细胞。结果发现雷帕霉素不能阻断AKT^S473的磷酸化，而Torin则完全阻断了Ism1诱导的AKT信号 (图4A)。强效和特异性的双重mTORC1和mTORC2竞争抑制剂INK-128也有类似效果(图4C)。这表明在Ism或胰岛素的分子调控通路中，mTORC1位于AKT下游或不参与Ism1和胰岛素信号，而mTORC2位于AKT的上游，是Ism1和胰岛素诱导信号级联所必需的。值得注意的是，在所有四种mTOR抑制剂都存在的情况下，Ism1诱导S6^S235/S236的磷酸化被完全抑制，这表明Ism1可诱导mTOR复合物的下游S6的激活 (图4A和4C)。使用S6K1激酶抑制剂DG2也证实了这一点，即DG2剂量依赖性地抑制S6^S235/S236，而pAKT保持不变。这些结果表明Ism1诱导的S6^S235/S236激活是位于AKT下游(图4D)。综上所述，这些数据有力的证明了Ism1信号与胰岛素具有共同的下游信号靶点，需要mTORC2参与诱导PI3K-AKT信号通路和葡萄糖摄取。

拓展阅读

胰岛素通路和mTOR通路：大佬之间的对决

mTOR(mammalian target of rapamycin, 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,负责调控细胞生长、分化和代谢中的多种信号通路。它包括雷帕霉素敏感的Raptor-mTOR复合物(mTORC1)和雷帕霉素不敏感的Rictor/mTOR复合物(mTORC2)。目前已有研究表明，胰岛素可以通过与mTOR通路相互调控从而维持葡萄糖摄取的平衡。在葡萄糖摄取过程中，胰岛素激活受体IR，磷酸化底物IRS，从而引起PIP3的活化，而PIP3的磷酸基团则可以同时招募PDK1(3-phosphoinositide dependent kinase-1, 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1)和AKT蛋白到质膜上，使PDK1磷酸化AKT（T308），并部分激活AKT。而mTORC2则可以磷酸化AKT的另一个活性位点（S473）从而彻底激活AKT和其下游的胰岛素信号通路。在活化后，AKT通过磷酸化TSC1/2(tuberoussclerosis protein, 结节性硬化蛋白)激活mTORC1，或是直接将与mTORC1相互作用的PRAS40在T246位点进行磷酸化从而引起负调控mTORC1信号。mTORC1上调下游的S6K1，在Ser307位点磷酸化IRS-1抑制其与胰岛素受体的相互作用。同时，mTORC1还可以抑制胰岛素在IRS-1 Ser636/639位点的磷酸化激活从而抑制胰岛素信号传导。

参考文献：

[1] Yoon MS et al.Nutrients. 2017;9(11):1176.

图3. Ism1可以激活PI3K-AKT通路

图S4.Ism1可以激活PI3K-AKT通路

图4.Ism1信号不依赖于胰岛素和胰岛素样生长因子受体

由于Ism1诱导的信号通路与胰岛素的作用类似，作者接下来想要探究Ism1是否直接与IR或IGF-1R结合，亦或使细胞对胰岛素更敏感来发挥作用。为了验证这一假设，在有无25或50nM的Ism1的情况下，用从1到100nM不同剂量的胰岛素处理3T3-F442A细胞。发现与单独使用胰岛素相比，Ism1和胰岛素共处理对AKT活性存在额外的增强作用，但没有观察到明显的共激活效应，这表明Ism1并不调节胰岛素-胰岛素受体的相互作用 (图4E)。同时为了探究Ism1是否能诱导IR磷酸化，分别用100nM的Ism1或胰岛素处理3T3-F442A细胞2分钟，WB检测IGF-IRβ的Tyr1135/1136和IR的Tyr1150/1151位点（两个常见的受胰岛素诱导的磷酸化位点）的磷酸化水平，发现胰岛素能诱导IGF-1R/IR磷酸化，而在Ism1处理的细胞中则没有发生磷酸化(图4F)。此外，为了验证Ism1诱导的pAKT信号是否需要完整的胰岛素受体，作者利用双受体酪氨酸激酶抑制剂OSI-906特异性靶向IR和IGF-1R。结果显示在1000nM OSI-906处理下，胰岛素信号完全消失，而Ism1信号即使在1000nM OSI-906条件下也是完整的(图4G)。同样的，OSI-906显著降低了胰岛素诱导的葡萄糖摄取，而Ism1诱导的葡萄糖摄取不受影响(图4H)。作者还发现，在3T3-F442A细胞中Ism1诱导的pAKT信号可被靶向多受体酪氨酸激酶抑制剂LDC1267抑制。然而无论LDC1267剂量是多少，PDGFββ或胰岛素诱导的信号都不会被其抑制，这表明Ism1具有独特的受体(图S4H)。综上所述，这些结果表明，Ism1信号不需要或不涉及胰岛素受体，而是通过一种与胰岛素具有共同的下游信号特征的独特受体来激活PI3K-AKT通路(图4I)。

6、Ism1过表达可预防饮食诱导的肥胖小鼠出现胰岛素抵抗和肝脂肪变性

为了研究体内循环Ism1长期升高的影响，对6~8周龄小鼠进行静脉注射AAV8-GFP/AAV8-Ism1，使小鼠循环Ism1水平显著升高，然后进行HFD喂养(图5A)。在相同条件下，与AAV8-GFP小鼠相比，AAV8-Ism1小鼠循环Ism1蛋白水平升高 (图5B)。在喂食10周的HFD后，AAV8-Ism1小鼠的体重增长显著低于AAV8-GFP小鼠(图5C)。体脂分析显示，体重差异是由于脂肪量下降导致的，而非瘦肉的减少(图S5F)。

在第10周时，AAV8-Ism1小鼠的糖耐量有所改善，胰岛素敏感性也显著增加(图5D和5E)。虽然随机血糖水平没有改变，但AAV8-Ism1小鼠的血浆胰岛素水平较低，这与Ism1改善外周胰岛素敏感性的功能是一致的(图S5I；5F)。为了验证AAV8-Ism1小鼠的全身胰岛素敏感性，作者在HFD喂养3周时进行了高胰岛素-正常血糖钳夹实验，此时组间体重无显著差异，实验过程中两组小鼠的血糖水平均被保持在约110mg/mL；AAV8-Ism1小鼠的葡萄糖输注速率增加，这表明胰岛素敏感性增加(图5G和5H)。有趣的是，无论是在基础条件还是钳夹实验条件下，与AAV8-GFP小鼠相比，AAV8-Ism1小鼠的内源性肝葡萄糖生成明显受到抑制(图5I和5J)。葡萄糖水平受胰高血糖素调节，可以增加血液中葡萄糖和脂肪酸的浓度；然而在没有fasting的AAV8-Ism1小鼠中，葡萄糖水平和胰高血糖素都没有改变(图S5I和S5J)。组织学分析和油红染色显示，与AAV8-GFP小鼠相比，在HFD喂养10周后，AAV8-Ism1小鼠的BAT和iWAT的脂滴变小(图S5K)，肝脏脂肪也显著减少(图5K)，表明AAV8-Ism1小鼠的脂质累积减少。同时还观察到与AAV8-GFP小鼠相比，AAV8-Ism1小鼠的肝脏组织中Srebp1c (Sterol regulatory element-binding protein-1c, 固醇调节元件结合蛋白-1c)的表达被显著抑制，另外Usf1(upstream stimulatory factor 1, 上游刺激因子1)、Fas(fatty acid synthetase, 脂肪酸合成酶)和Acc(acetyl CoA carboxylase,乙酰辅酶A羧化酶)的表达水平总体呈下降趋势，作者由此猜测肝细胞可能是Ism1的直接靶细胞 (图5L)。另外，AAV8-Ism1小鼠肝脏中甘油三酯也大幅减少(图5M)，而血浆胆固醇含量没有明显变化(图S5L)。总之，循环Ism1的长期升高可改善小鼠胰岛素敏感性和肝脏脂肪变性。

图5.Ism1-AAV过表达预防DIO小鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性

图S5.Ism1-AAV过表达预防DIO小鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性

由于AAV8-Ism1过表达在很大程度上阻止了肝脏脂肪变性的发展，作者想要进一步探究Ism1是否对肝脏脂质生成有直接或间接的影响。于是作者在原代小鼠肝细胞和小鼠肝细胞系AML12上开展了实验。在原代小鼠肝细胞过表达Ism1 24h后，Srebp1c的转录受到显著抑制，这表明Ism1可以直接调控脂生成基因表达(图6A)。众所周知，胰岛素可以通过调节SREBP-1c的活性和转录来驱动脂质从头合成。为了检测Ism1对Srebp1c及其靶基因的抑制作用是否足以减弱胰岛素诱导的肝细胞脂质从头合成，作者利用H³-醋酸盐标记脂肪酸和胆固醇（小编注：乙酰辅酶A是脂肪酸和胆固醇合成的底物，醋酸盐在体内可以转化成乙酰辅酶A，因此可以通过检测脂质中H³的量来确定脂质生成的能力），然后提取肝细胞AML12的脂质进行检测。结果显示50nM胰岛素显著诱导脂质生成，添加50nM和100nM的Ism1可以剂量依赖性逆转胰岛素诱导的脂质生成(图6B)。此外，在200nM超生理水平的胰岛素剂量处理时，50nM剂量的Ism1足以减少脂质生成，这表明Ism1对脂生成具有抑制作用(图S6A)。已有文献报道胰岛素通过PI3K-AKT通路驱动脂质从头合成导致mTORC1激活，从而促进Srebp1c的剪切，但其机制尚不明确。因此，作者接下来研究了在有无Ism1或胰岛素的情况下Srebp1c的剪切情况。结果显示50nM胰岛素处理的肝细胞中pre-Srebp1c和c-Srebp1的表达增加，Fas和Acc的蛋白表达也提升(图6C)。作者还发现Ism1可以抵消胰岛素诱导的Srebp1c剪切为成熟形态的增加，以及靶蛋白Fas和Acc表达的增加(图6C)，这表明Ism1抑制了脂质生成基因和蛋白的表达。因此，作者又检测了肝细胞中Srebp1c靶基因的表达水平，结果显示在胰岛素存在的情况下，Ism1以剂量依赖性方式显著降低了Fas、Acc和Scd1（已知的Srebp1c靶基因）的表达(图6D-6G)。同样，在原代脂肪细胞中，只有胰岛素才能诱导Srebp1c的表达，而Ism1不能诱导(图S6B)。此外，在胰岛素刺激条件下，Ism1可有效降低 c-Srebp1c蛋白水平，并抑制脂肪细胞中Srebp1c和脂质生成靶基因Acc、Fas和ChREBPβ的表达(图S6C-G)，这与Ism1抑制下游脂质生成的机制是一致的。但是，仍不能排除其他已知的调控脂质生成途径的参与，如ChREBPβ和Pgc1β，因为Ism1处理也抑制了这些基因表达(图S6H和S6I)。

为了确定Ism1抑制脂质生成的机制，作者接下来在肝细胞中进行了急性和长期信号转导实验。在有无25或50nM的Ism1的情况下，使用从1-100nM剂量的胰岛素急性处理肝细胞5min时，不会导致任何额外AKT磷酸化信号变化 (图S6J)，但24h处理显示Ism1诱导pS6^S235/S236（激活蛋白质合成的激酶）的过度激活(图6H和6I)。这便提出了一个问题，即长期暴露于Ism1是否会改变细胞合成代谢过程(包括脂质和蛋白质合成)的底物利用。实际上，通过检测H³-亮氨酸标记蛋白质的含量发现，长期Ism1和胰岛素联合处理可保持pS6^S235/S236水平并导致蛋白质合成增加2.9倍，这明显高于单独使用Ism1或胰岛素处理时的水平(图6J)。此外，在胰岛素存在的情况下，对Ism1在肝细胞中的对脂质生成和蛋白合成的作用进行直接并列分析，表明Ism1抑制脂质生成而有利于蛋白质合成，这有力的证明了Ism1将细胞合成代谢状态转换为蛋白质合成状态(图6K)。综上所述，这些结果表明，在胰岛素存在的情况下，Ism1直接作用于肝细胞，上调合成代谢蛋白信号通路和蛋白质合成，同时抑制Srebp1c靶基因和脂质生成。

拓展阅读

脂质生成知多少

SREBP(Sterol-regulatory element binding proteins, 固醇调节元件结合蛋白)是一类对细胞内胆固醇敏感的蛋白，属于bHLH-Zip超家族的一员。目前主要有3种：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。其中，SREBP-1c平时以pre-Srebp1c形式定位于内质网上，被剪切后形成c-Srebp1的激活形态，进入到细胞核中，作为转录因子来调控脂质生成基因的表达，包括ACC(acetyl CoA carboxylase,乙酰辅酶A羧化酶)、FAS(fatty acid synthetase, 脂肪酸合成酶)和LDLR(low density lipoprotein receptor, 低密度脂蛋白受体)等。有研究表明，胰岛素可以通过Akt和mTORC1两个通路激活SREBP-1c来发挥作用。

ChREBP（Carbohydrate response element binding protein, 糖类应答元件结合蛋白)是一种与糖类应答元件(ChRE)结合的蛋白质,可以调节糖脂代谢相关基因的表达。高糖条件下，PP2A(protein phosphatase, 蛋白磷酸酶2A)被激活，从而将ChREBP去磷酸化，增加其与DNA的结合活性。在激活后，其NLS位点在核内与Mlx(Max-like protein X, Max样蛋白)形成异源二聚体，与Acc1(acetyl-CoA carboxylase 1, 乙酰辅酶羧化酶)、Fasn(fatty acid synthase, 脂肪酸合酶)和Pklr(Pyruvate Kinase L/R, L型/R型丙酮酸激酶)基因启动子中的ChoRE(Carbohydrate response element, 碳水化合物反应元件)结合，激活转录，进而调控糖脂代谢相关基因表达。此外，ChREBP的活性还受到磷酸化、乙酰化和糖基化等多种转录后修饰的调控。

目前，已发现ChREBP的α和β两种亚型。与α型相比，β型因转录物长度较短，缺乏ChREBP-α在低血糖时调节转录活性的抑制结构域。因此，尽管ChREBP-β mRNA的表达量远不如 ChREBP-α，但其作用可能更强。此外，在ChREBP-β的启动子中，研究人员发现了α型中没有的ChoRE。因此，β-型的表达可能受葡萄糖和ChREBP-α调节。还有研究发现ChREBP-β mRNA 也在胰岛中表达，并参与葡萄糖刺激的 β 细胞增殖（尽管与α-型相比表达水平低得多））

PGC1(peroxisomeproliferator-activated receptor(PPAR)-γ coactivator 1, 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子)在许多代谢途径中起到了分子开关的作用。它包括PGC1α，PGC1β(也称为PERC)和PGC相关的共激活因子PRC，这些分子通过与不同的转录因子和核受体之间的相互作用来调控代谢酶活性。其中，PGC1α主要参与促进糖异生和脂肪酸β氧化，而PGC1β则在上调脂质生成和VLDL转运中起主要作用。在肝脏中，PGC1β通过直接共激活SREBP-1c和LXRα促进参与调节肝脏脂质稳态的基因表达。

参考文献：

[1] Wang Y, et al. Nat Rev MolCell Biol. 2015 Nov;16(11):678-89.

[2] Jing G, et al. Mol Metab.2016;5(12):1208-1215.

图6.Ism1抑制肝细胞脂质从头合成并促进蛋白质合成

图S6.Ism1抑制肝细胞脂质从头合成并促进蛋白质合成

8、重组Ism1治疗可改善糖尿病和肝脏脂肪变性

上述研究表明，Ism1具有强大的信号转导作用，其可以增加脂肪组织葡萄糖摄取，抑制脂质生成及增加蛋白质合成，这提高了Ism1作为治疗糖尿病和肝脏脂肪变性的药物的可能性。为了探究其治疗潜力，作者接下来在两种不同疾病的小鼠模型(饮食诱导肥胖DIO和NAFLD)进行一系列的Ism1给药研究，确定Ism1重组蛋白能否逆转小鼠已有的代谢性疾病。首先，对Ism1蛋白的药代动力学特性进行评估。将10mg/kg的Ism1重组蛋白静脉注射到小鼠体内，发现其在血液中的半衰期约为70分钟(图7A)，且没有观察到蛋白降解或裂解(图S7A)。为了验证Ism1能否在体内诱导AKT信号，作者分别给小鼠注射了对照、Ism1(10mg/kg)或胰岛素(1U/kg)，并在指定的时间采集组织。结果发现在iWAT和骨骼肌中，Ism1在30和60min时激活pAKT^S473信号；在BAT和肝脏中，Ism1在10min时就可以实现瞬时诱导(图7B)。为了确定最佳的体内Ism1给药剂量，作者进行了0.1mg/kg到10mg/kg 剂量-反应实验。结果显示5mg/kg的Ism1诱导pAKT^S473的水平最高(图S7B)。为了研究Ism1过表达的治疗效果，给HFD喂养16周(即DIO)的小鼠连续5天注射对照或5mg/kg的Ism1，结果显示两组间体重或血糖水平无明显差异，但葡萄糖清除率和胰岛素耐受略有改善(图S7C-G)，这表明连续5天注射Ism1具有治疗功效。

为了研究Ism1的长期治疗效果（与二甲双胍相比），并探究联合治疗是否比单独治疗更有效，将16周的DIO小鼠每天分别给予对照，5mg/kg的Ism1或100mg/kg二甲双胍，或者联合使用5mg/kg的Ism1和100mg/kg二甲双胍，为期21天(图7C)。实验结果显示各治疗组的体重和摄食量均无明显变化，但空腹血糖均低于对照组(图7D-F)。重要的是，与对照组相比，Ism1（单独）、二甲双胍（单独）和两者联合治疗对小鼠的葡萄糖耐受性都有类似的改善效果(图7G)。与单独治疗相比，联合治疗使小鼠的胰岛素敏感性更强(图7H)。这些结果表明，重组Ism1治疗可以改善小鼠的糖尿病。

考虑到Ism1对脂质产生具有抑制作用，作者下一步想确定Ism1是否能逆转小鼠的NAFLD。在治疗前，给小鼠喂食40%脂肪，2%胆固醇的饮食3周诱导NAFLD (图7I)。之后连续14天分别给小鼠注射对照、0.5mg/kg的Ism1或5mg/kg的Ism1。同时以每天注射30mg/kg的FXR激动剂GW4064作为阳性对照组。（此前有研究表明，14天的GW4064治疗可显著减少肝脏脂肪变性）。与NCD小鼠相比，NAFLD饮食喂养的小鼠肝脏重量增加、血糖升高，脂肪变性严重(图7J-7N)。治疗组之间小鼠的体重没有差异(图7J)，但与对照组（NAFLD）相比，5mg/kg Ism1组的小鼠的肝脏重量和血糖水平均有所下降，而Ism1浓度为0.5mg/kg 时则无变化(图7K-7L)。重要的是，5mg/kg的Ism1在减少肝脏重量、降低血糖和改善脂肪变性方面的治疗效果与GW4064作用类似。与对照组（NAFLD）相比，Ism1剂量为5mg/kg的小鼠肝脏大小和颜色也有明显的形态学改变(图7M)。此外，通过肝脏FAS蛋白水平和油红染色的对比分析显示，5mg/kg的 Ism1组与GW4064组在逆转肝脏脂肪变性方面具有相同的效果 (图7N和7O)。综上所述，这些数据表明，Ism1改善了小鼠的葡萄糖耐量，逆转了肝脏脂肪变性。

图7.重组Ism1治疗改善葡萄糖耐量和肝脏脂肪变性

图S7.重组Ism1治疗改善葡萄糖耐量和肝脏脂肪变性

在本研究中，作者发现了一种内分泌型多肽激素—sthmin-1（脂肪因子）可调节脂肪组织的葡萄糖摄取，同时减少肝脏脂肪变性。Ism1调控葡萄糖摄取的作用机制研究表明抑制PI3K通路可阻断Ism1和胰岛素诱导的AKT磷酸化和葡萄糖摄取，说明Ism1调控葡萄糖摄取同样通过经典的PI3K-AKT通路。同时，Ism1通过mTORC2通路调控PI3K-AKT通路，进而调控葡萄糖摄取，此过程独立于IR和IGF-1R。揭示了Ism1-mTORC2-PI3K-AKT与insulin-IR/IGF-1R-PI3K-AKT共同调控葡萄糖摄取。此外，重组Ism1可改善饮食诱导的肥胖小鼠糖尿病的发生发展，重要的是，与胰岛素促进肝脏脂质生成的副作用不同，Ism1能够改善饮食诱导的脂肪肝小鼠的肝脏脂肪变性。这些发现揭示了Isthmin-1作为一种特殊的生物活性蛋白激素，可能同时具有治疗糖尿病和脂肪肝的潜力。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413121003260

关注微信公众号代谢学人

了解更多代谢前沿资讯