编辑 | 孟美瑶

书接上回

上回书说道：

一分子葡萄糖被细胞摄取，

先是借助转运蛋白跨过细胞膜；

后又历经胞质糖酵解的十重关卡，

才最终“修成正果”——丙酮酸。

那么葡萄糖的闯关之路如此曲折

“新生儿”--丙酮酸肩负产能的重任 

接下来要如何打拼出一番事业

为机体做出贡献呢？ 

一起来瞧瞧糖酵解的后续↓↓↓↓↓↓ 

经济又高效的有氧供能途径---

三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA） 

让我们以丙酮酸的视角在TCA循环中走上一圈 

各位观众老爷们，这里先给您报个幕~

如果你热爱健身，想必一定听说过肌酸（Creatine），许多厂商将其制作成保健产品，有补充能量，肌肉增力等优点，那么肌酸究竟好在哪里呢？

肌酸产品广告

肌酸在体内能够被磷酸化为磷酸肌酸（Phosphocreatine，PC），PC充当能量的储剂，在机体需要能量时能够快速合成腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP），因此肌酸可以作为增强肌肉爆发力和耐力的补品。每天我们都要靠大量的ATP来供能，维持我们生龙活虎的状态，ATP结构中高能磷酸键的发现让”能量“不再是一个看不见摸不着的东西。

ATP的产生与消耗

ATP分子断裂高能磷酸键为机体供能

那么机体如何获取ATP呢？上回书中（好看的生化书——糖酵解篇、好看的生化书——糖酵解篇 完结篇）我们发现一分子的葡萄糖经历了细胞质中糖酵解作用（EMP途径），消耗2分子ATP，产生4分子ATP，净剩2分子ATP，同时生成2分子的丙酮酸和NADH。

通过EMP途径，一分子葡萄糖最终只产生了2分子ATP，实在不够用啊！真正的物尽其用，可不是随便说说而已，含有6个碳原子的葡萄糖，其价值远不止于此，若机体只靠糖酵解作用来获得能量，我们可能马上就会濒临死亡。因为多细胞生物不仅要维持细胞的生长分裂，同时还要负责整个机体的新陈代谢。对我们来说，光靠EMP来产能远远不够。

因此，在氧气的存在下，细胞利用线粒体作为产能车间，将葡萄糖的酵解产物丙酮酸通过三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）彻底氧化分解，充分发挥产能效应。

在谈具体的TCA反应流程前，先让我们看看丙酮酸面临的去向与抉择：

丙酮酸的命运抉择--无氧还是有氧？

葡萄糖的两种利用形式

无氧呼吸

葡萄糖经历EMP作用，将NAD⁺转变为NADH。NAD⁺是氧化还原反应中传递电子的辅酶，为细胞生存过程所必要。在无氧或是缺氧状态下，细胞通过无氧呼吸将丙酮酸转变成不完全代谢产物乙醇（植物中）或是乳酸（动物中）：丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化下，生成乙醛，进而被还原成乙醇；或是在乳酸脱氢酶的催化下，被还原成乳酸（见下图两条红色支路）。

丙酮酸的去向 

图片来源：（全网最科学谈酒-在喝酒与化学之间 - 知乎）

无氧呼吸只能够为机体提供2分子的ATP来维持机体基本的生存。但是，若细胞需要能量的快速供给时，无氧呼吸所介导的有机物不完全氧化过程产生的能量较少，细胞进而会加速糖酵解速率来补偿低的ATP产额，这一过程造成不完全氧化产物的积累，对细胞产生毒性（如动物的疾跑会造成乳酸堆积，破坏肌肉微细结构，导致肌肉酸痛的现象）；此外，无氧呼吸也加速了对糖的消耗，有耗尽可供呼吸物质的危险 [1]。所以无氧呼吸不能满足我们的生存需要，还可能给机体造成伤害。

工作学习、交流聚餐、唱歌跳舞、看书品茶，我们的生活行为如此复杂且丰富，糖酵解或无氧呼吸的产能效率显然不能满足我们的各种需求。在氧气的参与下，瞬间豁然开朗，胞质中的丙酮酸会优先进入到线粒体内（即上图第一条蓝色支路），先转换成高能分子乙酰CoA，再经过TCA循环彻底地氧化分解成CO₂和H₂O。TCA循环能够合成大量的ATP分子，为生命体的各种生理过程（如肌肉收缩、生物合成、细胞运动、细胞分裂、主动转运、神经转导等[2]）提供能量；同时，TCA循环这个能量圈圈，除了作为细胞能量这一“货币生产厂”以外，还是“底物中转站”和“代谢交流所”，可谓是多能代谢途径于一圈（“身”）。

因此，丙酮酸通过有氧呼吸进入TCA循环代谢产能，可说是多细胞生物向愈发复杂化进化发展的必然选择。

说了这么多，TCA循环到底是怎么样的“圈圈”？它又是如何运转的？别急，这就来啦~~

作为胞质中糖酵解的最终产物，丙酮酸有以下几种去向：在细胞质中：可通过无氧呼吸生成乳酸（或乙醇）、或与谷氨酸在谷丙转氨酶（Glutamate pyruvic transaminase，GPT）催化下生成丙氨酸和α-酮戊二酸。在线粒体中：在能量充足的情况下，丙酮酸在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase，PC）作用下生成草酰乙酸（Oxaloacetic acid，OAA），参与糖异生作用；在能量匮乏的情况下，丙酮酸则会优先转化成乙酰CoA，参与TCA循环，而这，就是我们故事的开端啦！ 

TCA的前期准备—丙酮酸变身乙酰CoA

华丽变身（丙酮酸脱羧加高能键--变成乙酰CoA）

丙酮酸在有氧状态下通过扩散作用穿过线粒体外膜，进入间隙中，再与位于线粒体内膜上的线粒体丙酮酸转运载体（Mitochondrial pyruvate carrier，MPC）结合，借助线粒体膜间隙的质子梯度（质子动力势）以协同运输的方式和质子一起转运到线粒体基质中，进而被基质内的丙酮酸脱氢酶系（pyruvate dehydrogenase complex，PDH）氧化成乙酰CoA。

等等，PDH是个啥？都包含哪些酶类？ 这些酶类又是如何协同地介导丙酮酸脱羧呢？快一起往下看吧!

丙酮酸转换成乙酰CoA

1.PDH构成：丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate dehydrogenase complex，PDH）是多种酶和辅助因子通过非共价键结合在一起形成的多酶复合体，包含三种酶类：丙酮酸脱氢酶（Pyruvicacid dehydrogenase，PDH，即E1）、二氢硫辛酸转乙酰酶（Dihydrolipoyl transacetylase，DLAT，即E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（Dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD，即E3）以及六种辅助因子：焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）、硫辛酰胺（Lipoamide）、辅酶A （Coenzyme A，CoA）、黄素腺嘌呤二核苷酸（ Flavin adenine dinucleotide，FAD）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺）以及镁离子（Mg²⁺）。

2.三步反应：丙酮酸转变为乙酰CoA的反应可以概括为以下三个步骤：丙酮酸的脱羧；碳单位的转移和氧化；氧化型硫辛酰胺的再生。反应将三碳（3C）的丙酮酸转变为二碳（2C）分子乙酰CoA。

咱们一步一步来看┗|｀O′|┛ 嗷~~

第一步：丙酮酸的脱羧

        E1借助TPP和Mg²⁺将丙酮酸（3C）的羧基脱去，生成CO2, 随后TPP接受反应后的乙酰基，乙酰基的羰基与TPP结合，发生加成反应，进而乙酰基变为羟乙基，生成了中间物羟乙基-TPP（2C）。

丙酮酸的脱羧示意图

丙酮酸的脱羧反应式

在E2的催化下，硫辛酰胺接受羟乙基-TPP中的羟乙基，形成中间物（乙酰二氢硫辛酰胺），进而在E2的作用下，CoA接受乙酰基，转变为乙酰CoA，此时硫辛酰胺的氧化型二硫键（-S-S-）被还原成两个分开的巯基（-SH）。

碳单位的转移和氧化示意图

碳单位的转移和氧化反应式

随后，E3借助辅因子FAD，将还原型硫辛酰胺氧化成原来的形式，二硫键（-S-S-）再次形成，而FAD则被还原成了FADH₂。之后，为了保证PDH反应前后功能上的一致，在E3的作用下将一分子的NAD⁺还原成NADH，使得FADH₂又恢复成原本的氧化态FAD，继续在PDH中发挥氧化硫辛酰胺的功能。

氧化型硫辛酰胺再生示意图

氧化型硫辛酰胺再生反应式

3. 调控：以上是丙酮酸进入TCA产能的前过程，生物能量利用的经济性使然，该反应受到严格而多样的调控，包括：PDH产物的竞争性反馈抑制（乙酰CoA和NADH）；E1的共价修饰调节，例如，E1受到丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate dehydrogenase kinase, PDK）和丙酮酸脱氢酶磷酸酶(Pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP)的磷酸化和去磷酸化修饰，磷酸化的E1为失活状态；而PDKs和PDP又受到别构调节，如细胞能量状态指示剂ATP、乙酰CoA和NADH能够激活PDKs，进而间接地抑制PDH的活性；而ADP和丙酮酸则能够抑制PDKs，并间接激活PDH的活性；胰岛素能够激活PDP，从而解除磷酸基团对于PDH的抑制作用。因此，PDH主要受到双酶的共价修饰调节，从而能够精确地根据细胞能量状态来影响糖代谢。

有PDH把关，TCA稳稳的

看到这里，你是否疑惑，PDH系统构成复杂，丙酮酸氧化脱羧步骤繁琐，细胞为什么不能简化反应？为什么不能让丙酮酸直接进入TCA循环中呢？

经过了PDH的洗礼，丙酮酸披上了华丽的外衣，转变成了高能分子乙酰CoA。乙酰CoA作为反应性强的高能小分子，不仅能够通过丙酮酸氧化脱羧产生；还能通过其他能源物质（如脂肪酸）分解代谢所产生，所以乙酰CoA可作为糖脂途径共同的代谢小分子参与TCA循环。

第一幕：脱羧阶段——CO2的释放

TCA循环中包含几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的有机酸（柠檬酸、异柠檬酸和草酰琥珀酸），故被称为三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle)），简称TCA循环。

TCA循环共包括8步反应，均在线粒体基质中进行。其中有三步不可逆，保证了TCA单向且有效的运转。最初，乙酰CoA作为一个二碳分子，加入到TCA的碳原子循环中，最终，以两分子CO₂的形式被完全的代谢掉。过程所释放的自由能推进了TCA后续反应中碳单位的转移和重塑，产生更多的高能分子ATP（由氧化磷酸化生成）和GTP（由底物水平磷酸化生成）等。

随着TCA循环中碳原子的转移，各个代谢分子都得到了更新和再生，这使得TCA循环和其他代谢途径的底物分配周转自如。

集中精力，

这是一场让人眼花缭乱的碳移位，满分操作来啦~

初入职场的乙酰CoA虽然只是一个含有高能键的“小小”二碳分子，却有着不小的野心和抱负，但踏入大门才发现自己一个大佬（酶）都不认识。草酰乙酸（Oxaloacetic acid，OAA）作为糖代谢的大红人，游荡在线粒体与细胞质基质中。它看到了乙酰CoA作为合资人的潜质，介绍给柠檬酸合酶（Citrate-synthase，CS）认识，乙酰CoA（2C）在伯乐OAA（4C）的游说下终于和CS握了手，最终和OAA合体，形成柠檬酸（6C）。

新人乙酰CoA

反应酶：柠檬酸合酶（Citrate-synthase，CS）是由两个亚基构成的二聚体，每个亚基的两个结构域构成一条较深的裂缝，其中含有草酰乙酸（Oxaloacetic acid，OAA）的结合位点。CS作为TCA循环第一步反应的催化酶，受到严格调控，该反应是不可逆的限速步骤。

反应流程：OAA与CS活性中心结合，使酶发生相应构象变化，从而创造出乙酰CoA的结合位点，CS的组氨酸残基掠取乙酰CoA的氢原子，使其碳原子不稳定，帮助乙酰CoA的负碳离子亲核进攻OAA羰基，二者偶联形成中间物（柠檬酰CoA），CS构象再次发生变化，天冬氨酸残基（Asp）切断柠檬酰CoA硫酯键，释放产物（柠檬酸和CoA）。反应释放的CoA可继续作为酰基载体，在氧化还原反应中被利用，而柠檬酸继续参与氧化分解。

自从和OAA合体以后，乙酰CoA变大了，也变强了，大家都叫TA：“柠檬酸”。

柠檬酸在TCA部门混了个脸熟，却没有进一步发展。请教了一圈，其他分子都说：“要想融入TCA，就要保持周转，不能停滞不前。”于是职场小白柠檬酸决定改变自己，适应这里！柠檬酸本身不易氧化。因此，柠檬酸找到了造型师ACO帮忙打理外（结）表（构），一番脱水加水、羟基移位操作，成功变身为易于脱氢氧化的异柠檬酸。

我要变形啦

反应酶：乌头酸酶（aconitase，ACO）本质上是一个铁硫蛋白。含有由共价键结合的4个铁原子、4个无机硫化物和4个半胱氨酸硫原子形成的Fe-S聚簇。Fe-S聚簇可参与底物的脱水和再水合作用。

反应流程：柠檬酸的羟基处于第三位碳原子上，属于叔醇化合物，其本身的结构不利于氧化。为了参与下一步的氧化脱羧，柠檬酸在ACO作用下，先脱水再加水，使柠檬酸羟基由β碳原子转移到α碳原子上，实现了羟基的异位转变，羟基加在第二位碳原子上，成为了拥有伯醇基的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。

柠檬酸异构化形成异柠檬酸

反应酶：异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是多亚基变构调节酶，介导TCA连续两步氧化还原反应，先脱氢后脱羧。在真核生物线粒体中，IDH能够利用NAD⁺作为氢的受体，使得β-羟酸（异柠檬酸）氧化成β-酮酸（草酰琥珀酸），草酰琥珀酸结构不稳定，促进相邻C-C键的断裂，生成α-酮戊二酸，同时释放一分子CO₂和一分子NADH。

异柠檬酸氧化形成α-酮戊二酸

初战告捷后，α-酮戊二酸转到了大佬α-KGDHC手下干活。新工作很有挑战性，一开始进展不大，有同事开始在背后说闲话，说上次的NADH大单只是运气好。成熟的职场人当然不能受别人负能量的影响，深吸一口正能量（CoA-SH）的α-酮戊二酸（5C）再接再厉，又签到了NADH大单，扬眉吐气CO₂，蜕变成拥有高能硫酯键的资深职场人琥珀酰CoA（4C）。

资深大佬气场就是不一样

反应酶：α-酮戊二酸脱氢酶系（ α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDHC）由三个酶 （α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶）和五个辅酶 （TPP、硫辛酸、CoA、NAD⁺、FAD）组成。该酶是催化TCA中第二次氧化脱羧反应，反应不可逆，需要NAD⁺和CoA作为辅助因子。

反应流程：在α-KGDHC催化下，CoA的高能硫酯基团转移氢原子到NAD⁺，NAD⁺形成NADH。CoA中不稳定的高能电子进攻羰基碳原子，导致-C-C-键断裂，生成带有高能硫酯键的琥珀酰CoA，释放1分子CO₂，产生1分子NADH。

到这里为止，六个碳的柠檬酸共脱去两个羧基，释放出2分子CO₂。聪明的你可能早已发现经过刚才脱羧阶段的四步反应，释放出的两分子二氧化碳中的碳原子都是来源于OAA，而乙酰CoA的碳原子仍完整保留（快倒回去看看，红框框里的属于乙酰CoA的两个碳原子是不是一直都没变？）。

实际上，TCA循环的八步反应可被大致分为两个阶段：脱羧阶段和再生阶段，到刚才的第四步为止，这轮TCA循环的脱羧反应已经全部结束了（即第三、四步反应），在这之后就再没有碳原子的丢失了。那么，最初来自乙酰CoA的两个碳原子要经历多少轮TCA循环才能完全代谢掉（即来自最初的乙酰CoA的两个碳原子全部以CO2的形式被丢失，不再存在于碳骨架体系中）呢？

答案：4轮

每一轮TCA循环均会生成两分子的CO_２，第一轮TCA循环所释放的两分子C均来自于OAA（C１和C４），而乙酰CoA的两个C原子在第一次TCA循环的时候转变成了第二轮TCA中OAA的C１和Ｃ２；在进行第二轮TCA循环的时候，OAA的C１生成了CO２（来自乙酰CoA），C２变成了C３位；第三轮TCA循环时，OAA中的（来自乙酰CoA）C３位进一步变成C４位。在第四次TCA循环时，OAA中C４位的碳原子最终变成CO_２释放出去，即完成了最初的乙酰CoA的碳原子的完全释放。因此乙酰CoA的两个C原子要经历４次TCA循环才能释放出去，从而被完全的氧化分解。

从职场小白（乙酰CoA）晋升为TCA高管的琥珀酰CoA，一入职便成绩斐然，利用自身的高能硫酯键与能量供应商GDP进行资源整合，产生了大批能量分子GTP，为TCA部门带来很大收益，琥珀酰CoA也因此再次晋升，成为TCA老大琥铂酸。

反应酶：琥珀酰CoA合成酶（Succinyl-CoA synthetase，SCS）由α和β两种亚基构成（分别由SucD和SucC两个基因所编码），在线粒体基质中，SCS通常以αβ二聚体发挥功能，Mg²⁺对酶的活性很重要。SCS催化琥珀酰CoA高能硫酯键水解是TCA循环中唯一一步底物水平磷酸化反应。

反应流程：在SCS的催化下，琥珀酰CoA拥有的高能硫酯键被水解，高能键断裂，释放的大量自由能通过底物水平磷酸化以GTP的形式储存下来，并转变成琥珀酸。反应生成的GTP可直接利用，也可以和ATP相互转换，此外，GTP还可以提供鸟嘌呤核苷酸用于DNA复制和转录反应。

小总结：从上述TCA的五步反应中我们可以看出，这个过程中释放了2分子的CO₂，两分子NAD+被还原成NADH，同时还通过底物磷酸化产生了一分子高能磷酸基团（GTP）。哦，对了，十分重要的一点是，该过程产生的NADH后续又可以通过线粒体内膜上的电子传递链被氧化成NAD⁺，一方面完成NAD⁺的循环再生，另一方面参与线粒体膜间隙质子梯度的建立，为合成更多ATP分子做出贡献。

回顾了下目前的成果，可谓收获颇丰。其他乙酰CoA听说自己的同辈在TCA部门混得很好，也纷纷前来报道。但是，之前协助乙酰CoA融入部门的伯乐OAA已经蜕变为琥珀酸了。面对后续涌入二碳分子们，TCA部门又该如何保证TA们能够被持续氧化代谢，使得能量持续产生呢？

抢OAA啦！

这里就要 cue TCA循环里的“循环”二字啦！循环是以乙酰CoA和草酰乙酸的缩合生成柠檬酸为起始。现在乙酰CoA源源不断的进入，打配合的草酰乙酸不够了，怎么办？不用担心，小小的细胞极具智慧，接下来的重头戏就是琥珀酸如何重返初心、再生为草酰乙酸，达成循环之旅啦！生命体通过形成循环实现底物和酶的再利用，既体现了经济性，又能够实现对能量代谢的整体调控，瑞思拜！

TCA循环转起来！‍

反应酶：琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase， SDH）属于氧化还原酶，是 TCA循环中唯一一个整合在线粒体内膜上的多亚基酶。FAD⁺作为SDH的辅基，其第8位碳原子与酶的组氨酸残基通过共价键的形式连接。 

反应流程： SDH以FAD⁺作为琥珀酸脱去氢离子的受体，介导琥珀酸两个碳原子之间的氧化，即碳-碳键（-C-C-）的氧化脱氢。

反应酶：延胡索酸水合酶（Fumarase hydratase，FH）的催化反应具有严格的立体专一性，只能催化一种构型的底物。该反应过程的-OH严格地加在靠近延胡索酸双键的一侧，而另一个-H加在相反的另一侧，从而只能形成单一构象的产物。由于FH活性中心只能和一种异构体匹配，结合/生成单一结构的底物/产物（L-苹果酸），使得FH相对于其他酶类显得比较特别，TCA循环中的其他酶类只区分底物类型，对于底物的异构体并无要求。 

反应流程：在一分子H₂O参与下，延胡索酸酶的活性中心特异性地结合底物延胡索酸，催化延胡索酸双键打开，发生加成反应，生成L-苹果酸，其具有β-碳原子位置上的羟基，从而为OAA的再生做准备。

反应酶：苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）作为TCA循环中最后一个氧化还原酶，辅酶为NAD⁺。作为唯一一步可逆的氧化反应，该过程的正反应标准自由能变化ΔG>0，在热力学上是不利于进行的，但由于TCA第一步反应中：OAA和乙酰CoA反应自由能变化ΔG<0，是高度放能的反应，非常利于进行，因此OAA作为第一步的底物更容易被消耗，使得第八步的正向反应虽然不易进行，但随着产物OAA的消耗（乙酰CoA与OAA的结合，记不清的小伙伴请倒回去看第一步~），正反应也得以进行，即一个热力学上不利的反应（苹果酸生成OAA）借助与其相偶联的热力学上的有利反应（乙酰CoA与OAA结合的放能反应）的推动而变得可行。

反应流程：MDH氧化L-苹果酸，使其羟基形成羰基，转变成OAA，NAD+作为氢原子受体，生成NADH。此步骤达成了OAA的再生和TCA循环的闭合。重新生成的OAA可以和乙酰CoA再次结合形成柠檬酸，参与新一轮的TCA循环。

哦，对了，细胞能量充足时，OAA还可以跨过线粒体内膜，进入到细胞质基质参与糖异生，具体将在第三幕介绍哦~

L-苹果酸脱氢形成草酰乙酸

小结

整个TCA循环的8步反应包括4次氧化脱氢、2次脱羧、1次底物水平磷酸化、1次异化、水合、缩合反应。由TCA介导的4步氧化脱氢反应发生在线粒体内部（分别是第3,4,6,8步，其中第3，4，8步发生在线粒体基质；第6步在线粒体内膜上），其产生的NADH和FADH₂可以直接进入位于线粒体内膜的氧化呼吸链进行电子传递。根据对呼吸链中质子的贡献程度，NADH可以再产生2.5个ATP分子；FADH2可以再产生1.5个ATP分子。

由于篇幅限制，《三羧酸循环之丙酮酸升职记》到这里先中场休息一下，等道具师换幕布和道具，我们下周同一时间再见，敬请关注噢~

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