代谢学人

Nature Medicine：时间都去哪儿了？还没胖够，你就老了

编辑 | 孟美瑶

背景介绍

肥胖作为糖尿病、心血管疾病和癌症等多种慢性代谢疾病的重要诱因，是当今世界面临的主要健康挑战之一。人类的脂肪组织主要通过脂肪细胞的肥大而扩张，脂肪细胞体积的增加与身体质量指数（BMI）和循环胰岛素水平密切相关；且脂肪细胞周期进展与肥胖和高胰岛素血症相关。

人体中多种类型的细胞都可以通过核内复制来适应细胞体积的大幅增加。在核内复制过程中，完全分化的细胞重新进入细胞周期，合成DNA但不进行分裂，导致大的细胞DNA含量、核大小与核数量增加。然而人类脂肪细胞是否存在这样的机制目前尚不清楚。人脂肪细胞的体积在其整个生命周期中可以增加200倍以上，那么，脂肪细胞如何适应如此巨大的体积变化呢？有研究表明，脂肪组织的扩张是由于脂肪细胞祖细胞（间充质干细胞）分化和成熟脂肪细胞大小的增加。然而，通常认为成熟的脂肪细胞无法分裂，不能进入细胞周期（细胞周期：从一次细胞分裂完成时开始到下一次细胞分裂完成时为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞），仅通过数百倍增大自身体积，来适应脂肪组织的扩张。

促炎性脂肪细胞分泌模式在肥胖时增强，且在大的脂肪细胞中尤为明显；然而，脂肪细胞肥大和促炎分泌的潜在机制仍不明确。早衰是一种可以诱发促炎分泌模式的细胞程序。与年龄诱导的衰老相反，由应激刺激(如有丝分裂原、DNA损伤或线粒体功能障碍等)引起的早衰，正迅速成为许多慢性疾病背后的病理机制之一。同时，肥胖和糖尿病通过诱导高血糖水平和氧化低密度脂蛋白介导的细胞过早衰老而加速衰老。

由于先前普遍认为，脂肪细胞是有丝分裂后的细胞，使得脂肪细胞在衰老诱导的病理条件下的影响往往被忽视。近期一篇发表在Nature Medicine上题为“Obesity andhyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce”的文章，证明了成熟的人类脂肪细胞可以激活细胞周期程序，并重新定义了一种成熟的人类脂肪细胞的衰老机制。本研究发现在成熟的人类脂肪细胞中具有一个意想不到的、活跃的细胞周期程序，对其进行持续的促有丝分裂刺激(如慢性高胰岛素血症)可以导致促炎性衰老表型。使用二甲双胍可抑制皮下脂肪组织中衰老的诱导。

敲黑板：

1、成熟的人类脂肪细胞可以激活细胞周期程序；
2、体外胰岛素治疗促进细胞周期进程，引起细胞核大小和DNA含量增加；
3、衰老的脂肪细胞高表达CCND1，并在高胰岛素血症肥胖个体中不断积累；
4、二甲双胍可抑制上游有丝分裂信号传导，抑制皮下脂肪组织中衰老的诱导。

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研究结果

1、成熟的人类脂肪细胞可以激活细胞周期程序

为了研究人类脂肪细胞中与肥胖和高胰岛素血症相关的细胞周期程序，作者从13名受试者中分离出成熟的皮下腹部脂肪细胞进行RNA-seq（图1a）。根据受试者的代谢特征，将测序的脂肪细胞样本分为三组：瘦个体（lean）、正常胰岛素血症肥胖个体（OB/NI）和高胰岛素血症肥胖个体（OB/HI；C 肽水平≥1.2nM）。其中，受试者C肽水平（衡量胰岛素水平的指标）和全身胰岛素抵抗程度显著相关(图S1f)。通过对DEGs（differentially expressed genes，差异表达基因）进行无监督聚类分析来表征上述测序样本（图1b，图S1g，图S2）。在OB/HI受试者中发现与细胞周期的进入和进展相关的基因，而这些基因在先前的细胞生物学研究中并未涉及（图1c和图S2）。

拓展阅读

高胰岛素血症

高胰岛素血症(Hyperinsulinemia，HIS)主要是指与血糖水平不相适应的胰岛素水平升高，胰岛素浓度超过正常生理水平的现象。该现象常与因肥胖引起的胰岛素抵抗共存，但两者并非完全一致。高胰岛素血症会引起严重的危害。在脂肪组织和肝脏中，高胰岛素血症具有双面作用。一方面，它可以抑制脂肪分解，降低棕色脂肪中UCP1、PGC1α等的表达，降低棕色脂肪细胞的胰岛素敏感性。另一方面，高胰岛素血症会促进脂肪组织炎症，加剧白色脂肪的脂肪酸从头合成等代谢过程的破坏，加剧肝脏异位脂肪堆积，引起NASH以及其并发症，如缺血性卒中、高血压、糖尿病、慢性肾病、心律失常等发病风险增加。而对于肌肉来说，胰岛素水平过高则导致动脉粥样硬化血脂异常，引起心肌异位脂肪堆积，从而对心肌细胞和骨骼肌细胞产生损害。此外，对于女性而言，高胰岛素血症会刺激卵泡膜细胞增生，也可以刺激卵巢上皮细胞产生雄激素，引起高雄激素血症，引发排卵功能障碍和多毛、痤疮等皮肤病症。因此，高胰岛素血症的早期识别和有效干预对于糖尿病患者的预后有很重要的意义。

参考文献

[1]  Rajan S et al. J Endocrinol. 2016 Sep;230(3):275-90.

[2]  Pedersen DJ et al. Mol Metab. 2015 May 1;4(7):507-18.

[3]  .Wang J et al. Life Sci. 2019 Nov 1;236:116940.

首先，作者探究了刚分离的成熟人类脂肪细胞是广泛表达细胞周期相关转录程序还是仅选择特定基因进行表达。目前研究认为分离的人类脂肪细胞能够表达CCND1（Cyclin D1，细胞周期蛋白D1）和CDK4（Cyclin-dependentkinase-4，细胞周期蛋白依赖性激酶-4），但其与脂肪细胞的细胞周期相关功能无关。出乎意料的是，作者发现了许多经典细胞周期标志物的广泛表达，其中包括其他的细胞周期蛋白、复制前以及复制相关的复合体、DNA聚合酶、黏连蛋白和复制依赖性组蛋白（图1d）。此外，在测序的脂肪细胞样本中，也发现了绝大多数已知的（以复制依赖方式表达）S期相关转录物的表达（图S1h）。通过分析与特定细胞周期阶段相关的基因，作者发现了三组样本间的差异表达模式，其中瘦个体主要表达G1期沉默或阻滞的标志物；OB/NI个体的嵌合表达模式（mosaic expression pattern ）表明其具有活跃的细胞周期进程；OB/HI个体的G1/S期标志物表达水平较低，G2期特异性转录物却不断积累，这表明细胞周期进展与肥胖和胰岛素血症之间存在联系（图1d）。qPCR结果显示，与非肥胖(withoutobesity, WOB)个体相比，OB/HI个体的S/G2标志物CCNA2（Cyclin A2，细胞周期蛋白A2)表达水平更高（图S1i）。此外，作者还发现脂肪细胞缺乏编码有丝分裂蛋白的大多数转录物，这表明尽管脂肪细胞的细胞周期程序活跃，但似乎并不是通过有丝分裂进行的（图1d）。

图1.成熟的人类脂肪细胞表达细胞周期转录谱

拓展阅读

细胞周期

细胞周期是指细胞从一次分裂完成时开始到下一次分裂完成时为止。绝大多数真核细胞的细胞周期分为间期与分裂期两个阶段，其中间期又细分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。细胞周期存在检验点，只有当内外条件合适的时候，才能够进入下一个时期，完成有丝分裂，而当条件不合适时，则会发生阻滞，即停留在细胞周期的某个时期。G1期也被称之为第一间隔期，是细胞周期的第一阶段，主要合成生长所需的蛋白质、糖类和RNA等，但不合成DNA，其特点是物质代谢活跃，合成迅速，细胞体积显著增大。其主要意义是为S期的DNA复制做好物质和能量的准备。在G1期晚期阶段有一个特定时期，被称为R点(Restriction point, 限制点)，如果细胞能够在内外条件刺激下通过R点，则进入S期。否则则被阻滞，进入G0期（脱离细胞周期循环，直到条件合适重新进入细胞周期进行分裂）。目前，关于G0期的检查主要以Ki-67检测为主，Ki-67在所有细胞周期中均表达。但当细胞进入G0期等从而退出细胞周期时，Ki-67的表达水平则显著降低。

在进入S期后，细胞立刻开始合成DNA。此阶段细胞主要负责合成DNA、组蛋白和DNA复制所需的绝大部分酶体。

复制完成后，细胞即进入G2期。此时DNA已经合成完毕。其他结构物质和相关的亚细胞结构也完成了进入M期的准备。和G1期类似，在G2晚期仍存在一个判断是否进入M期的检控点。若无法通过则变为G2期细胞，等待受到刺激后进入周期完成细胞分裂。此阶段主要的标志物为pHH3和CCNA2。前者作为一种核心的组蛋白，其在Ser-10和Ser-28位点上的磷酸化转变可以作为“驱动”染色质凝聚的反式作用因子从而诱导G2期进入M期。而CCNA2则结合CDK1(Cyclin dependent kinase,细胞周期蛋白依赖性激酶)和CDK2产生CCNA2-CDK复合物，该复合物通过促进S期中的DNA和中心体复制并在G2期推动有丝分裂来进入M期。除了主要处于S期和G2期的CCNA以外，处于G1晚期的CCNE和处于G2和M期的CCNB1也分别作为细胞周期的标志物被广泛检测。

M期为细胞分裂期，在此阶段细胞进行有丝分裂（体细胞）和减数分裂（生殖细胞）。该阶段细胞形态结构发生急速变化，但其呼吸作用降低，蛋白质合成速度明显下降，RNA等其他物质合成几乎停滞。在细胞完成分裂后，则立刻重新进入G1期准备下一次循环。

参考文献：

[1]  Sun X et al. Chromosoma. 2018 Jun;127(2):175-186.

[2]  Hendzel MJ et al. Chromosoma 1997 Nov;106(6):348-60.

图S1. 分离的人体脂肪细胞的纯度和细胞周期转录谱的表达

图S2. 不同患者群体之间的基因表达差异

为了验证该转录结果，作者对分离的成熟脂肪细胞进行细胞周期蛋白染色，通过共聚焦显微镜观察发现许多细胞周期蛋白在其活性状态下定位于细胞核，于是，使用凝集素对脂肪细胞质膜进行共染色来进一步确认脂肪细胞内的细胞核定位（图2a）。ICC(Immunocyto-chemistry，免疫细胞化学)染色证实了转录数据结果，显示出一部分成熟脂肪细胞容易表达一般细胞周期相关蛋白，如PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen，增殖细胞核抗原)和anillin(苯胺素)，以及Ki-67和CCND1，CCNE1（Cyclin E1，细胞周期蛋白E1）和CCNA2（Cyclin A2，细胞周期蛋白A2）的核表达（图2a-c）。同时，作者对G2/M期标志物pHH3(phosphohistone-H3，磷酸组蛋白H3)进行染色，来检测有丝分裂的脂肪细胞。结果显示在成熟脂肪细胞中出现G2期相关的典型斑点状，而无明亮的M期相关染色特征（图2b,c）。同样的，anillin（有丝分裂过程中能转移到细胞质和细胞膜）也未在脂肪细胞核外观察到（图2b,c）。此外，在整个研究过程中，通过DAPI染色没有发现具有有丝分裂核或浓缩染色体的脂肪细胞。为了证实脂肪细胞分离过程中的胶原酶处理不会导致脂肪细胞再进入细胞周期，作者对不同独立个体的脂肪组织块进行IHC染色（补充表3）。IHC结果显示所有检测到的细胞周期标志物均在脂肪组织块内的成熟脂肪细胞中表达（图2d）。以及在任何脂肪细胞中均未观察到表明有丝分裂的CCNB1的核表达。然而，在成熟脂肪细胞的细胞质中存在CCNB1，表明可能处于G2期（图2d）。总之，这些数据表明显示活跃细胞周期特征的成熟人类脂肪细胞不存在有丝分裂。

图2. 成熟的人类脂肪细胞细胞周期标志物呈阳性

为了表征体内脂肪细胞的细胞周期动力学，作者检测了每个标记物的脂肪细胞核阳性的百分比（图2e）。定量分析显示出个体和标记物之间存在相当大的异质性：CCND1（启动细胞周期进入，并在整个细胞周期中维持表达）表达存在差异性（1-97％阳性细胞/个体；图2b,e）；在G1/S期表达的CCNE1也广泛表达（7-99%阳性细胞/个体；图2b,e）。与预期结果相一致的是，G2期阶段的两个标志物CCNA2和pHH3的表达水平较低（CCNA2，1-64%阳性细胞/个体；pHH3，0-49%阳性细胞/个体；图2b,e)。这些结果证实了在活跃的细胞周期中，人成熟脂肪细胞表达的转录物和蛋白质谱具有相当大的个体差异。

2、脂肪细胞周期进程与肥胖和高胰岛素血症相关

为了更好地了解个体间细胞周期蛋白表达的变化，作者进一步分析了受试者的临床参数，包括肥胖测量值（BMI、体脂成分、脂肪质量（kg）和腰围）和循环血清成分，确定了肥胖和胰岛素参数（C肽、血清胰岛素水平和HOMA-IR）是与细胞周期标志物相关的最重要的临床因素（图3a和图S3a）（小编注：（C肽，C-Peptide，又称连接肽，由胰岛β细胞分泌，前体是胰岛素原。胰岛素原经过剪切生成等分子量的胰岛素和C肽，又因为C肽半衰期长，因此可以通过检测血液中C肽的水平来反应胰岛素的含量）。同样的，CCND1和CCNA2的mRNA水平也与受试者C肽水平和BMI相关（图S3b）。而在非糖尿病患者队列中没有发现这些细胞周期蛋白与长期血糖水平(HbA1c)或年龄之间的相关性（图3a和图S3a、图S4）。

为了确定肥胖或高胰岛素血症是否推动脂肪细胞周期进程，对CCNA2（CCNA2是S/G2期细胞的蛋白标志物，可以鉴定已经发展到静止G0/G1期之后的细胞）和受试者临床参数进行了多元β回归分析（图S4）。结果显示，当调整参数时，肥胖测量值（以kg为单位的脂肪、体脂成分和BMI）可以对CCNA2的表达造成显著差异（图3b、c）。每增加一公斤脂肪量，CCNA2阳性的几率增加4.9%（95%CI（confidenceinterval，置信区间；1.2%，8.8%）P=0.01；图3d）。利用拟合的β回归模型，将肥胖对细胞周期进程的单独影响进行可视化分析，并将预测CCNA2阳性的脂肪细胞百分比含量作为脂肪量增加的函数（图3d、e）。胰岛素（C-肽）的调节作用显示出较高水平；然而，较大的置信区间使得调节并不能引起显著差异（图3b）。定量PCR和测序结果表明，受试者高胰岛素血症与G2标志物富集的转录谱相关（图1d和图S3）。

图3. 脂肪细胞周期进展与肥胖和高胰岛素血症有关

图S3. 脂肪细胞周期再进入标志物与代谢参数相关

图S4.统计分析细胞周期相关指标与患者临床参数的相关性

3、胰岛素在体外驱动脂肪细胞进入细胞周期

为了探究高胰岛素血症是否可以作为有丝分裂原并刺激脂肪细胞通过S期，作者使用基底细胞培养基(使用FBS，通常含有50pM胰岛素)培养人类脂肪组织块或刚分离的脂肪细胞，并加入或不加入外源性胰岛素(100 nM)(图4a)。为了追踪DNA合成路线，将EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)和荧光染料添加到培养基中，并用共聚焦显微镜测量脂肪细胞核大小。培养4天后，完整脂肪细胞内的EdU阳性脂肪细胞核清晰可见，表明成熟的人类脂肪细胞可以在体外合成DNA（图4b），在基础培养基中培养的脂肪细胞也能够合成DNA，而在添加100nM外源性胰岛素组中，EdU阳性脂肪细胞的百分比和平均脂肪细胞核大小显著增加（图4c, d）。相比之下，使用活性炭处理过的FBS（CT-FBS；去除胰岛素和生长因子）（小编注：有文献报道，经过活性炭吸附的FBS常用于激素相关的实验研究，以提供无激素的细胞培养条件。此外，在蛋白质方面的研究表明，包括胰岛素样生长因子2（IGF-2）和IGF结合蛋白（IGFBP）-2和-6在内的14种蛋白质在这种FBS中减少。）培养导致DNA合成水平显著降低（图4e）。与预期一致，胰岛素培养4天后，与EdU阴性脂肪细胞相比，EdU阳性脂肪细胞的细胞核更大，这表明脂肪细胞核大小的增加与DNA复制有关（图4f）。接着，使用DNA染料进行细胞核染色和流式细胞分析，结果显示，胰岛素培养4天的脂肪细胞亚群中的DNA含量增加了一倍，证实了EdU动力学，且说明细胞周期完全进展到S期（图4g和图S5a）。

据文献报道，在许多核内复制的细胞类型中，核的大小与细胞大小相关。虽然脂肪细胞肥大与肥胖相关，但目前对脂肪细胞核大小却知之甚少。在本研究中，作者发现刚分离的非培养的脂肪细胞的细胞大小随BMI增加而增加，并表明细胞大小也与核大小相关（图4h）。与细胞核大小的增加一致，与瘦个体相比，肥胖个体的细胞核DNA含量增加（图S5b）。S/G2期标志物CCNA2阳性的细胞核也明显多于CCNA2阴性的细胞核（图S5c）。总之，这些数据表明肥胖和高胰岛素血症是成人脂肪细胞和细胞核大小增加的驱动因素。体外胰岛素治疗可以促进细胞周期进程，引起细胞核大小和DNA含量增加。

图4. 胰岛素诱导脂肪细胞周期再进入和EdU进入

图S5. 胰岛素诱导脂肪细胞周期再进入和EdU进入

4、在肥胖和高胰岛素血症中，胰岛素激活脂肪细胞中胰岛素受体信号

在体外实验中，作者测量了胰岛素刺激后脂肪细胞中的EdU染色比例，并进一步研究受试者代谢健康如何影响脂肪细胞通过S期的细胞周期进程。从OB/NI和OB/HI个体以及未肥胖WOB（Without obesity）个体中分离的脂肪细胞样品在含或不含基础或外源胰岛素的情况下培养4天，并检测EdU阳性脂肪细胞的百分比含量。与先前研究一致，肥胖个体细胞周期标志物表达增加（图1d和3a-c），表明在基础状态下，个体肥胖程度（以kg为单位的脂肪量）与EdU阳性脂肪细胞的百分比呈正相关（图S5d）。胰岛素治疗增加了所有个体的EdU染色水平（图4c）；然而，在高胰岛素血症个体中，EdU染色水平的倍数变化减弱（图S5e）。对胰岛素的促有丝分裂反应性降低可能反映了OB/HI个体中G2期停滞的脂肪细胞比例增加（图1d和3a）或细胞对胰岛素的反应减弱。为了验证脂肪细胞对胰岛素的反应能力并非受肥胖或循环C肽水平的影响，作者使用100nM胰岛素刺激刚分离的非培养脂肪细胞10分钟，然后进行WB，结果显示所有脂肪细胞样品中AKT-Ser473的磷酸化水平显著升高（图4i和图S5f）。尽管在OB/HI个体中GLUT4表达的降低表现出胰岛素抵抗，但AKT的激活与BMI、循环C肽水平或HOMA-IR无关，这证实了人脂肪细胞仍保留了对胰岛素的应答能力（图4i）。

通过对三名肥胖个体的皮下脂肪细胞响应胰岛素水平（范围：0.1-100nM）的深入分析表明，尽管高胰岛素血症患者的几种胰岛素反应蛋白的表达较低，但其相对磷酸化反应相对一致（图4J和图S5g）。这些结果表明，CCND1位于促有丝分裂胰岛素信号通路的下游，其表达模式与胰岛素反应相反，且在高胰岛素血症个体中可以检测到更高水平的CCND1。

热图结果显示：其中基因表达发生显著变化的共有1416个基因，在WT和ACTN3 KO小鼠中，地塞米松注射3小时的转录变化影响最为显著(图3A)。火山图分别显示了地塞米松处理(图3B)后的差异表达基因和ACTN3 WT和KO(图3C)影响的差异表达基因变化。进一步通过相关性分析结果发现，虽然在地塞米松处理后3小时和24小时后，WT和ACTN3 KO小鼠对地塞米松处理具有类似变化(图3D)，但是通过Pearson相关系数对ACTN3的基因型和地塞米松影响的交互作用分析显示，ACTN3 KO小鼠对地塞米松的反应存在特异性的差异表达基因，其中包括了5个特别的基因[Tmem100(q=0.00623)、Cbx8(q=0.049)、Mras(q=0.049)、2310022B05Rik(q=0.0550)、和Mstn(q=0.1238)]，且这些基因与肌肉生长与消耗或免疫表型相关的信号转导途径有关。

进一步的基因富集分析显示了ACTN3基因型对地塞米松的总体反应(图3F)，结果表明：地塞米松产生的效应与“细胞外渗的调节”、“单核细胞趋化的调节”和“细胞防御反应”等免疫反应相关与相关，而ACTN3基因型效应则与“肌肉适应”和“肌肉萎缩”相关。进一步分析显示， ACTN3基因型对地塞米松的反应也存在不同发育时间性的差异，这种差异主要体现在淋巴细胞迁移和肾上腺素受体信号上。WT和ACTN3 KO的“淋巴细胞迁移的正向调节”的对比图(图3G)表明在没有ACTN3的情况下，骨骼肌对地塞米松的免疫抑制反应减弱。总之，上述结果进一步证明了ACTN3 KO可以缓解肌肉中地塞米松诱导的肌肉萎缩反应。

5、高水平的CCND1 与衰老标志物的表达有关

与肥胖、细胞大小（图4h）和CCND1、CCNA2、pHH3（图3a,b）的正相关相反的是，增殖标志物Ki-67和PCNA（Ki-67或PCNA的表达降低是细胞周期结束的标志）的表达随着肥胖的增加而降低(图5a)。随着高胰岛素血症水平的下降其表达也相应降低（图S6a）。此外，来自OB/HI个体的脂肪细胞具有G2期标志物（图1d和3a)，表明它们可能在G2期中被阻滞并结束细胞周期。如上所述，来自高胰岛素血症个体的脂肪细胞也表达高水平的CCND1（图3a和4j）。据文献报道，这些标志物除了具有启动细胞周期中的作用之外，还发挥多种非经典作用。为了探究脂肪细胞表现出高水平的CCND1，低表达水平的Ki-67和PCNA的原因，作者利用转录数据对所有CCND1相关转录物的富集途径进行分析，结果表明在其相关的信号通路中，细胞衰老是最重要的通路，其次是与细胞周期进程和DNA损伤反应相关的通路（图S6b）。此外，脂肪细胞CCND1表达与几种衰老相关转录物的表达有关（图5b）。总之，这些数据表明，衰老的脂肪细胞高表达CCND1，并且衰老的脂肪细胞在高胰岛素血症肥胖个体中不断积累。

图5. 肥胖和胰岛素抵抗可诱导脂肪细胞衰老

图S6. 肥胖和胰岛素抵抗可诱导脂肪细胞衰老

6、高胰岛素血症导致成熟的人脂肪细胞衰老

已有文献报道，小鼠脂肪组织和人前体脂肪细胞存在细胞衰老的现象，但在人成熟脂肪细胞中没有描述。作者通过对刚分离的脂肪细胞进行SABG(β-半乳糖苷酶活性染色)，证实了人成熟脂肪细胞能够发生细胞衰老。WOB个体和OB/NI个体的脂肪细胞中SABG染色非常弱甚至无法被检测到，但高胰岛素血症的受试者中SABG染色效果明显（图5c）。对单个脂肪细胞进行SABG染色呈现核周染色模式，与组织切片中β-半乳糖苷酶蛋白的IHC染色结果相同（图5d和图S6c）。对SABG阳性脂肪细胞百分比含量定量分析发现，与OB/NI和WOB个体相比，OB/HI受试者中衰老脂肪细胞的百分比含量显著增加（图5e和图S6d）。对OB/NI和OB/HI个体的BMI数据分析发现驱动脂肪细胞衰老的主要原因并不是肥胖，而是高胰岛素血症（图S6e，S7）。为了进一步证实这一结论，作者进行了多重零膨胀β回归分析。该模型预估有68%的个体对脂肪细胞衰老敏感，并证实胰岛素血症是唯一显著影响易感受试者衰老脂肪细胞比例的因素（图5f)。对于易感受试者，每增加1nM的C肽，SABG阳性细胞的几率便会增加6.9%，表明高胰岛素血症的强烈作用（图S6f）。重要的是，年龄和性别的调整效应无统计学意义，且未发现SABG染色结果与人年龄之间存在相关性（图2，图5f，g和图S6g）。

接下来，作者检测了衰老细胞的其他标志物。结果显示，HMGB1(Highmobility group B1,高迁移率族蛋白B1，一种成熟的衰老标志物）的缺失与SABG阳性细胞的百分比相关（图5b），证实了SABG的实验结果（图S6h和S7）。与衰老导致细胞大小增加说法一致的是，同一个体的SABG阳性脂肪细胞也明显大于SABG阴性细胞（图5h）。不仅如此，在脂肪细胞中典型的衰老标志p16蛋白表达水平显著升高（图5i），p16阳性的脂肪细胞百分比含量与受试者C肽水平相关（图5j）并显示出随BMI增加的趋势（图5k）。p16(CDKN2A)在测序数据中的mRNA表达水平非常低，说明其仅受到较弱的转录调控（图5b和6e）。相反，在高胰岛素血症的肥胖个体中p21(CDKN1A)的转录水平大幅上调（图5b），这进一步证实了慢性高胰岛素血症可以导致细胞周期阻滞和细胞衰老。由于DNA损伤已被证明可诱导细胞衰老，作者便通过持续的、易扩散的γ-H2AΧ染色检测脂肪细胞的细胞核，来研究稳定且未被修复（non-resolved）的DNA损伤反应的表达（图5I）（小编注：细胞在发生DNA双链断裂后，随即产生一系列的应激反应，许多翻译后修饰作为损伤应答的分子开关。H2AX是组蛋白H2A家族成员之一，在细胞发生DNA双链断裂后被ATM，ATR和PRKDC磷酸化，形成γH2AX，进而迅速招募DNA修复蛋白和凋亡蛋白到损伤部位。由于γH2AX的出现与DNA双链断裂紧密关联，可以作为DNA双链断裂的标志物。）。结果发现γ-H2AΧ染色程度随受试者BMI增加而增加，但不随C肽的变化而变化（图5l-m）。这一结果与先前的研究一致，表明了在肥胖人群中存在活跃的DNA损伤反应。综上所述，这些数据表明人类脂肪组织中的成熟脂肪细胞可以激活细胞周期程序和与高胰岛素血症有关的细胞衰老，并表达大多数典型的衰老标志物（图S7和补充表9）。

与静止期细胞相比，衰老细胞具有高度的代谢活性，可以释放出更高水平的促炎细胞因子和趋化因子。衰老相关分泌表型（SASP）的分泌谱已被公认是组织和全身健康的负调节因子。然而，其在细胞类型和组织之间差异很大。为了确定衰老脂肪细胞中的SASP，作者使用候选基因的方法来分析新分离的脂肪细胞的测序数据（图1d），以筛选与p21表达相关的SASP相关转录因子。发现有16个转录物符合筛选要求（图5b），qPCR结果表明其中有5个转录物（IL6、IL8、IL1B、CXCL10、CXCL2）的表达增加（图S6i和补充表10）。总之，以上结果显示了因衰老而表达上调的脂肪细胞衍生的促炎因子的表达谱，并表明脂肪细胞衰老会促进肥胖、高胰岛素状态下的慢性低度炎症。

图S7. 统计分析衰老相关指标与个体临床参数的相关性

7、细胞周期动力学控制脂肪细胞衰老

为了确定持续的胰岛素暴露能否推动细胞周期进程以及随后的细胞周期终止和衰老，作者将刚分离的人脂肪细胞在含有EdU和100nM外源性胰岛素的条件下培养4或7天（补充表11和12）。结果发现，持续的胰岛素暴露略微增加了DNA合成，同时显著增加了SABG阳性脂肪细胞的数量（图S8a，图6a）。为了探究衰老脂肪细胞的增加是否是由持续的胰岛素暴露而非由延长的培养时间引起的，在脂肪细胞中加入或不加入外源性胰岛素培养7天后，发现胰岛素培养显著增加了脂肪细胞衰老，而用PI3K抑制剂LY294002共处理可以延缓脂肪细胞衰老（图6b-d）。将胰岛素培养7天的样品进行RNA-seq分析显示，与SABG的染色结果一致，胰岛素处理上调了大部分衰老转录物的表达，但没有影响细胞活力（图6e，S8b）。为了研究长期胰岛素处理对脂肪细胞SASP和促炎信号的影响，作者检测了培养基中SASP蛋白的表达水平。虽然长期胰岛素处理明显增加了衰老脂肪细胞的数量，但只有少数SASP蛋白表达水平显著增加（图6f）。然而，到第7天时大多数SASP蛋白都有增加的趋势，这表明在较晚的时间点可能更好地捕捉到更显著的SASP变化。

图6  细胞周期开始或停滞与脂肪细胞衰老有关

图S8. 脂肪细胞衰老与细胞周期开始或停滞有关

衰老被认为是持续的有丝分裂刺激和内源性CDK抑制剂（如p16和p21）表达之间的内在冲突引起的。为了研究高胰岛素血症诱导的细胞周期重入进程是否可以调节人脂肪细胞的衰老，作者使用了目前市场上用于其他方面治疗的两种药物：用于治疗乳腺癌的帕博西尼(Palbociclib，0.5uM），类似于p16和p21，其通过抑制CDK4/CDK6阻断细胞周期；二甲双胍(metformin，5mM)，常用于治疗2型糖尿病，其能够阻断mTOR介导的CCND1上游的促有丝分裂信号。EdU染色水平下降表明这两种药物均可有效抑制人脂肪细胞的细胞周期进程（图6g-j）。帕博西尼对CCND1水平的影响较小，因为它阻止了细胞周期的进程而非细胞周期的启动（图6h）。作者通过帕博西尼与促有丝分裂刺激（胰岛素）的联合处理，以增强内部细胞周期和细胞阻滞的冲突比率，来模拟内源性p16/p21活性， SABG染色结果显示脂肪细胞衰老程度增加（图6i）。SABG对帕博西尼治疗的反应高度依赖于个体的血清胰岛素水平，其中高胰岛素血症个体的脂肪细胞样本的SABG染色效果最强（图S8c）。在胰岛素存在下，帕博西尼也增加了除p21和p16以外的几个衰老相关基因（图6e）。然而，在培养7天后，帕博西尼并未显著增加SASP的分泌，这表明尽管帕博西尼阻断细胞周期进程可以诱导SABG，但此时并不足以诱导SASP（图S8d)。先前的文献研究表明，单独使用帕博西尼无法诱导SASP，还需要使用MEK抑制剂联合处理。

与帕博西尼相比，二甲双胍不仅降低了细胞周期进程，而且还有效地减少了mTOR信号，如mTOR下游靶标p70S6K的磷酸化水平（图6j，S8e，S8f）和CCND1蛋白的表达水平（图6k）均大幅下降。此外，与单独使用胰岛素或胰岛素与帕博西尼联合处理相比，二甲双胍显著降低了所有样本中衰老SABG阳性细胞的百分比，且与活检供体的代谢状态无关（图6l和图S8g）。不仅如此，二甲双胍还阻断了衰老转录程序的表达，而不是诱导与静止相关的基因的表达（图6e）。这与LY294002（图6b-d）处理结果一致，均抑制了AKT-mTOR通路上游的促有丝分裂胰岛素信号并显著降低了脂肪细胞的衰老（图6d）。二甲双胍治疗7天显著降低了大多数SASP的分泌（图6f）。这种降低不是由于蛋白质分泌的普遍下调，因为在二甲双胍处理后培养基中没有检测到脂联素（或选择性的SASP蛋白）分泌水平的差异，也没有检测到任何细胞毒性或细胞破裂（图S8h,i）。这些数据表明，抑制细胞周期进入上游的脂肪细胞衰老可能引起脂肪组织功能的抗炎作用（图S9a）。

综上所述，本研究证实了在促有丝分裂信号增加的情况下，如慢性高胰岛素血症或体外长期胰岛素刺激，可以通过引起细胞周期进展使皮下脂肪细胞数目增加，细胞周期阻滞剂p16和p21的转录表达增加和衰老脂肪细胞的数量增加。通过使用帕博西尼培养脂肪细胞能够增强细胞周期阻滞从而增加衰老脂肪细胞数量，而使用二甲双胍或LY294002抑制上游有丝分裂信号传导能够完全抑制皮下脂肪组织中衰老的诱导（图S9a）。

图S9a. 抑制上游有丝分裂信号传导能够完全抑制皮下脂肪组织中衰老的诱导

总结

此前，脂肪细胞被认为无法分裂或进入细胞周期。本研究证实，成熟的人类脂肪细胞显示出一种细胞周期程序活跃的基因和蛋白质特征。脂肪细胞周期进展与肥胖和高胰岛素血症相关，并伴随着细胞大小、核大小和核DNA含量的增加。体外或人体内慢性高胰岛素血症与随后的细胞周期结束有关，导致脂肪细胞的转录组和分泌谱过早衰老。进一步研究表明，通过使用二甲双胍靶向脂肪细胞周期程序，有可能影响脂肪细胞衰老和肥胖相关脂肪组织炎症。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41591-021-01501-8

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