引言

精彩回放

背景知识

肝原代提取的前期准备

答疑小课堂

常见的肝细胞系有HepG2，Hepa1-6等，HepG2是来源于一个15岁白人的肝癌组织；Hepa1-6来源于小鼠肝癌，两者都属于永生细胞系，当然也有永生细胞系具有的通性缺点，如与正常肝脏细胞相比遗传物质发生改变，生物学特性会随着细胞分裂次数的增加而发生迁移等。

原代细胞是指从机体获取组织细胞后的首次培养。由于离体时间短，因此其能够保持在体内的生物学特性，与细胞系相比，是更接近体内环境的研究模型。

肝脏是作为机体“核心”的代谢器官，其组成是极其复杂的，除了肝细胞，还包含众多内皮细胞、免疫细胞等组分，各类细胞功能各异并相互交流，共同决定肝脏的代谢表型。因此，当我们要研究某一表型究竟是由于肝细胞自身的变化引起的，还是由其他细胞类型所介导的时，使用小鼠肝脏组织是无法说清问题的，使用原代肝细胞能够避免其他细胞的影响，从而得到更加准确地结论。

原代细胞相对于体内实验，更加可控，可给予的实验干预也更多。

关于胶原酶的介绍，详见《原代脂肪细胞提取之准备篇》。

其中Ⅱ、Ⅳ型胶原酶均可以用于分离原代肝细胞，性价比较高。另外还有价格美丽的肝细胞专用胶原酶。

“杰瑞”的年龄最好在6-8周，这个年龄段的小鼠提取出原代肝细胞活力更高，便于后续的培养和实验。年龄过小，由于肝门静脉过细，灌流时插管困难；而年龄过大的小鼠肝细胞经过灌流和消化后，细胞更易被损伤，导致细胞获得率低或活力较低。当然，所有技术都是为目的服务，根据具体研究内容选择小鼠，才是王道。

 灌流液（buffer I）的组分及原理：

HEPES缓冲液：一种氢离子缓冲剂，稳定溶液pH

EDTA：Ca²⁺螯合剂，与肝脏上皮细胞中的钙粘蛋白形成螯合物，便于细胞解离

葡萄糖（Glucose）：调节渗透压，保持细胞活性，利于后续细胞培养

离子（KCl，NaCl）：调节细胞渗透压，保持细胞活性

 消化液（buffer II）的组分及原理：

胶原酶Ⅳ：消化组织间的胶原纤维，使组织分散成单个细胞，便于后续的细胞培养

HEPES缓冲液：一种氢离子缓冲剂，稳定溶液pH

EDTA：Ca²⁺ 螯合剂，与肝脏上皮细胞中的钙粘蛋白形成螯合物，便于细胞解离

葡萄糖（Glucose）：调节渗透压，保持细胞活性，利于后续细胞培养

离子（KCl，NaCl，CaCl₂）：调节细胞渗透压，保持细胞活性

首先，所有的细胞培养过程都要求的无菌，在原代中更是如此。无菌！无菌！无菌！重要的事情说三遍。手术器械一定要灭菌，同时不同用途的剪刀镊子不可混用；灌流液，消化液配制完成后进行过滤除菌处理；“杰瑞”处死后彻底消毒防止毛发污染。

第二是在灌流和消化过程中，保持合理的灌流速度，不可过快也不能过慢。过慢会导致血液清除不净，消化不够，导致提取失败；过快则会导致消化液在肝脏中停留不够，导致消化不够，也会导致提取失败。

最后，在提取完成离心过程中，重悬所用DMEM一定要预冷；重悬手法一定要轻柔，防止细胞受到二次机械损伤。

结语