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2022年9月,美国斯坦福大学的研究人员在国际著名期刊Nature上发表了题为CLN3 is required for the clearance of glycerophosphodiesters from lysosomes的文章,阐述了他们开发的一种研究溶酶体功能的新方法,并使用该方法阐明了Batten病的发病机制。
溶酶体正常功能的发挥至关重要,许多人类疾病由溶酶体功能障碍导致,如阿尔茨海默病等神经退行性疾病、溶酶体贮积症(LSDs)。尽管许多LSDs的致病基因已经被找到,但是这些基因的致病原因尚不明确,很大一个原因是溶酶体只占细胞体积的一小部分,溶酶体内容物的变化很难被发现。CLN3基因缺陷会导致Batten病,一种罕见的遗传性疾病,属于进行性退行性神经代谢疾病--神经元蜡样脂褐质沉积症;Batten病的症状通常出现在5至15岁之间,主要症状包括视力丧失、肌肉协调性缺乏、智力低下或精神功能受损、情绪障碍、癫痫发作、肌肉痉挛、肌张力下降和运动障碍。在本研究中,研究人员构建了LysoTag小鼠,并使用该小鼠对CLN3的功能进行研究,发现了CLN3蛋白是溶酶体中清除甘油磷酸二酯(GPDs)的所必须的,并揭示了Batten病是一种具有GPDs代谢缺陷的神经退行性LSD。
为了构建LysoTag小鼠,研究人员将编码溶酶体定位的TMEM192-3×HA融合蛋白的cDNA整合到Rosa26基因座下游的lox-stop-lox(LSL)盒并产生了一个转基因小鼠系,然后将这些转基因小鼠与表达CMV启动子驱动的Cre重组酶的小鼠进行杂交,最终产生了LysoTag小鼠。LysoTag小鼠在各组织中组成性地表达TMEM192-3×HA。使用免疫荧光对LysoTag小鼠的肝脏和大脑切片分析发现,TMEM192-3×HA与溶酶体标记物LAMP1有协同作用;并且LysoTag小鼠的溶酶体蛋白、酶活性或溶酶体超微结构没有影响。
图1. LysoTag小鼠的产生以及用于组织中溶酶体的蛋白质组学和代谢物分析
研究人员使用磁珠选择性地收集LysoTag小鼠的所有溶酶体(LysoIPs)。为了测试LysoIPs在研究溶酶体代谢物方面的可行性,研究人员首先对LysoIPs产物的成分进行分析,发现沉淀物富含溶酶体膜和腔内蛋白LAMP1和cathepsin C,但不含其它细胞器的标志物;其次,研究人员对胱氨酸水平进行测量--胱氨酸在溶酶体中富集--与对照组免疫沉淀物或全肝样品相比,肝脏LysoIPs的胱氨酸水平高出很多;最后,研究人员对正常进食或禁食的小鼠肝脏溶酶体代谢物谱进行分析,虽然一些禁食引起的溶酶体代谢物的变化在整个组织水平上也能被检测到(如乙酰肉碱),但其它的代谢物只在溶酶体中观察到。这些数据表明,LysoIP可完整且高纯度地分离LysoTag小鼠器官中的溶酶体,并用来研究传统方法无法检测的溶酶体代谢物的变化。
为了确定CLN3缺失引起的溶酶体代谢组的变化,研究人员将LysoTag小鼠与Cln3-/-小鼠杂交,使用非靶向脂质组学的方法来分析CLN3-/-小鼠的脑溶酶体中积累的代谢物变化,发现Batten小鼠脑溶酶体中GPD增加。为了进一步阐明CLN3-/-小鼠脑溶酶体中GPD升高的原因,研究人员使用HEK293T对CLN3与溶酶体GPD之间的关系进行了研究:首先通过内吞作用,将带有标记的磷脂送到溶酶体,在溶酶体分解后,会产生带有标记的GPD;然后使用质谱法监测带有标记的GPD的命运,发现在缺乏CLN3的细胞中,标记的甘油磷酸甘油(GPG)被困在溶酶体中,没有在细胞膜中被分解;此外,在CLN3缺失的细胞中,还观察到了带有标记的溶血磷脂酰甘油(LPGs)的显著积累,而LPGs是GPD的直接上游代谢物。因此,CLN3参与将从磷脂中释放的GPD运出溶酶体。
总之,本文的研究人员表明了CLN3是GPD从溶酶体释放的必要条件;并证实了使用LysoIP与非靶向代谢物分析相结合的方法来研究溶酶体相关疾病的发病原因、阐明相关基因功能的可行性。
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撰文:贾魏珉
编辑:刘振兴
审核:张贤钦
课题组网址 http://life.hust.edu.cn/info/1046/13645.htm
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