替代或编辑致病突变对治疗许多人类疾病有着巨大的希望，然而在体内向特定细胞传递治疗性基因修饰物一直具有挑战性，特别是在大面积的、分散的组织中，如骨骼肌。2021年9月，美国布罗德研究所团队与哈佛大学团队合作在cell上发表了“Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species”一文，研究人员建立了一种体内策略来定向进化和严格选择腺相关病毒（adeno-associated viruses, AAVs）的衣壳变体，从而能够有效地传递到所需的组织。利用这种方法，研究人员鉴定了一类含有RGD基序的衣壳，在小鼠和非人类灵长类动物静脉注射后具有优越的效率和选择性转导肌肉细胞。

重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated viruses, rAAVs）在临床前和临床研究中是体内基因替代治疗和基因编辑最常用的载体，但系统传递后特定组织的选择性转导仍然是一个挑战。使用天然衣壳产生的重组AAV在全身注射后主要被隔离在肝脏中，这种隔离限制了AAV在其他器官中转导的效率，特别是骨骼肌。由于肌肉占总体重的40%，实现具有天然衣壳变体的肌肉治疗，需要注射极高的病毒剂量。

研究员通过对C57BL/6J小鼠进行两轮严格的、基于转录本的选择，筛选了C57BL/6J小鼠多个不同肌肉中MHCK7启动子表达的衣壳变体。对第一轮病毒库进行测序，发现了超过500万个独特的衣壳变异。在第一轮筛选后，选择了在7块肌肉（前四头肌、前胫头肌、腓肠肌、三头肌、腹部、膈肌和心脏）中高表达的变异（图1A和1E）。

图1.DELIVERY识别出一类包含RGD基序的嗜肌AAV衣壳变异体

研究员发现了一类含有RGD的衣壳变体，包括MyoAAV1A，在不同的小鼠品系中的系统肌肉转导方面的效率是AAV9的10倍以上。为了研究MyoAAV1A系统传递后的转导谱和生物分布，研究员注射成年C57BL/6J小鼠1E+12vg（~4E+13vg/kg）AAV9-或MyoAAV1ACMV-EGFP，分析注射2周后不同组织的转基因表达和载体基因组丰度。与注射AAV9的小鼠相比，注射MyoAAV1A的小鼠肌肉中的荧光强度要高得多（图2A）。重要的是，MyoAAV1A比AAV9更有效地转导心脏，心脏是许多遗传性肌病的关键受影响器官。免疫荧光分析进一步证实了注射MyoAAV1A的小鼠的肌纤维和心肌细胞中具有较强的转基因表达（图2B）。值得注意的是，在C57BL/6J小鼠中，MyoAAVA1A显示肝脏转导相对减少，表明与AAV9相比，该变体具有肝脏脱靶转导谱（图2A-2C）。

图2.MyoAAV1A在全身注射后能高效转导小鼠骨骼肌

MyoAAV1A的进一步进化导致了小鼠嗜肌衣壳变体的产生，包括MyoAAV2A。研究员研究了MyoAAV2A通过低剂量病毒在不同小鼠组织中的转导效率，将C57BL/6J小鼠注射2E-AAV9-、MyoAAV1A-或MyoAAV2A-CMV-EGFP的+11vg（~8E+12vg/kg），分析转基因在不同组织中的表达和载体基因组的生物分布。全组织荧光成像显示，与MyoAAV1A或AAV9相比，MyoAAV2A系统基因传递导致更高水平的转基因表达（图3C和3D）。EGFPmRNA的定量结果显示，MyoAAV2A传导小鼠骨骼肌的效率是AAV9的10-80倍，传导心脏的效率是AAV9的17倍。此外，与注射AAV9的小鼠相比，注射MyoAAV2A的动物肝脏中转基因mRNA的表达量低2.5倍（图3E）。同样，载体基因组生物分布分析显示，与注射AAV9的小鼠相比，注射MyoAAV2A的小鼠骨骼肌和心脏vg/dg显著升高，肝脏vg/dg显著降低（图3F）。

图3.进一步进化MyoAAV1A产生更增强的嗜肌衣壳变体

在这项研究中，研究人员报道了一个跨物种的高效肌肉定向AAV衣壳变异家族的进化、工程和机制特征，并在多种遗传肌肉疾病小鼠模型中证明了这些载体即使在低剂量时也具有良好的治疗效果，这些载体有潜力推进肌肉定向基因治疗大量肌肉疾病。

参考文献：Tabebordbar, M., Lagerborg, K. A., Stanton, et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species[J]. Cell, 2021, 184(19) : 4919-4938.e22.

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撰文：孙廿一

编辑：刘振兴

审核：张贤钦