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狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告(1) 前言
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人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告
1. 前言
为了确定替代方法的可用性和验证状态，以期在狂犬病疫苗效力检测中进一步减少、优化、取代（3Rs）动物使用，美国国家毒理学项目替代性毒理学方法跨部门评估中心（NICEATM）和替代方法验证跨部门协调委员会（ICCVAM）举办了一次国际研讨会：“人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法：科学现状和未来规划”。这次研讨会是在替代检定方法国际合作伙伴组织的共同努力下组织的，包括欧盟的动物试验替代品参考实验室（EURL ECVAM）、日本的替代方法验证中心（JaCVAM）和加拿大卫生部。本次研讨会于2011年10月11-13日在美国爱荷华州Ames国家动物卫生中心举行。来自14个不同国家超过80位代表政府、工业界和学术界的科学家参加了研讨会。本次研讨会包括16个大会报告，随后是三个分组会议，主要集中在以下议题：
l 审查目前可用的替代方法的科学现状，并确定为了使正在监管测试中的方法能立即执行所必须解决的任何尚未解决的数据缺陷。
l 制定实施策略和计划，以解决这些知识和数据方面的缺陷，获得监管机构认可、达到实用化、扩大替代方法在常规的狂犬病疫苗效力测试中的应用，从而确保能持续保护人类和动物的健康。
l 结合狂犬病疫苗效力检定的体外检定方法，精确确定目前可用于评估批与批之间一致性的过程控制参数和测试方法的有效性和合法性。
l 对当前小鼠攻击检定程序的各种修改进行评估和鉴定，以减轻或避免疼痛和痛苦，减少动物的使用。
l 确定狂犬病疫苗效力检定的当前和未来综合方法的最佳方案，以尽量减少动物的使用。
在研讨会开幕式上，William Stokes博士（NIEHS，美国国立卫生研究院，美国）首先解释了ICCVAM是一个跨部门委员会，负责推动可以减少、优化（较少疼痛和痛苦）和取代动物试验的替代方法的验证和监管机构的认可，同时保持对人类和动物健康以及对环境的保护。ICCVAM是由15个美国联邦管理和研究机构成员组成，这些机构需要、使用、产生或发布为确保人和动物健康所必需的有关毒性、安全性和其他类型的测试信息。 ICCVAM依据法规适用性对新的、已修订的替代检定方法进行技术评估，并给各机构提供正式建议。与NICEATM合作，ICCVAM和其成员机构促成超过50种替代检定方法获得监管部门认可。Stokes指出，这次研讨会是一系列专门的疫苗研讨会中的第一个，目的是进一步讨论在2010年NICEATM-ICCVAM关于疫苗效力和安全性测试替代方法国际研讨会上已经明确的优先项目。疫苗检定替代方法是NICEATM和ICCVAM目前四个最优先项目中的一个，因为有大量动物用于这类检定，还因为实验动物会经历极端的不能缓解的疼痛和痛苦。
本次研讨会的报告提供了发言者陈述中的要点，还包括对被研讨的每个关键领域的讨论总结、结论和建议。大会发言提供了关于狂犬病对公共健康和动物健康重要性的概述，当前美国和国际上人用和兽用狂犬病疫苗效力检定的监管指南，以及改进、减少和取代狂犬病疫苗效力检定替代实验的当前状态和可用性。
1.1. 狂犬病 – 公共卫生和动物卫生问题
Charles Rupprecht博士（CDC，USA）阐述狂犬病是一种在传统的传染病中病死率最高、急性、进行性、无法治愈的病毒性脑炎。作为一种古老而被忽视的人畜共患病，狂犬病造成了沉重的国际负担，给公共卫生、农业和生态保护都带来危害。狂犬病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，除南极洲以外各大洲都有发现。由于所有哺乳动物都易感，因此有效的疾病预防和控制变得很复杂。狂犬病毒的传播通常是通过被感染宿主咬伤而发生。在全球范围内，家犬是唯一最重要的动物储存宿主，而在发达国家，野生动物种群（例如狐狸、浣熊、臭鼬、蝙蝠等）是森林型狂犬病感染的另一个储存宿主和传染源。
每年，估计超过1千5百万人在狂犬病暴露后接受狂犬病暴露后预防治疗。治疗包括多次注射狂犬病疫苗和免疫球蛋白。尽管有这一高度有效的预防方法，狂犬病每年仍然引起全世界超过70,000人的死亡。在非洲和亚洲的发展中国家，人体暴露主要发生在年幼的儿童，并且狗构成占主导地位的传染源。在美国，人狂犬病是比较少见的，每年需要使用暴露后预防的具有潜在风险的暴露有20,000至40,000，死亡病例每年1-8个。
在欧洲、日本、加拿大、美国和其他发达国家，狗和猫的强制性疫苗接种已经有效消除了这些物种中的地方性动物狂犬病。为了尽量减少人类狂犬病的暴露风险和死亡率，对狗和野生动物进行协调的大规模疫苗接种显然是最具成本效益的方式。全球消除（elimination）犬狂犬病仍然是一个现实的目标。正在进行的消除措施包括：1）推进犬和野生动物的疫苗接种计划，2）改进诊断和监测技术，3）建立鼓吹和提高知晓度的国际通信网络（例如，世界狂犬病日活动），4）供应纯净、高效价、安全、有效的疫苗。
Cristina Cassetti博士（NIAID，USA）概述了当前由国立过敏和传染病研究所（NIAID）资助,开发经改进和更廉价的狂犬病疫苗和治疗方法的研究成果。这些成果包括只需要较少剂量的减毒活疫苗，以单克隆抗体鸡尾酒疗法取代狂犬病免疫球蛋白预防暴露后的个体，以及热稳定的野生动物疫苗。NIAID也提供重要的资源，包括新出现病毒和虫媒病毒世界参考中心（WRCEVA）和生物防御和新出现感染研究资源库（BEI）。
1.2. 狂犬病疫苗 - 美国和国际法规要求
几乎所有灭活人用和兽用狂犬病疫苗的常规批签发都需要用狂犬病毒毒株进行小鼠效力攻击实验，以确保最终产品是高效价的。当前的一个例外是日本用体外ELISA效力试验批签发无佐剂兽用狂犬病疫苗。对效力检定的要求在监管机构之间仅仅有轻微差异，在历史上都是基于小鼠攻击实验。因为起源于美国国立卫生研究所，故称为“NIH试验”。NIH试验使用数组小鼠，用特定批号的疫苗进行若干次连续稀释后进行免疫，然后脑内注射活狂犬病毒。在感染后第6 - 9天，用作阳性对照和那些没有得到疫苗充分保护的小鼠会出现狂犬病临床症状（例如瘫痪、麻痹、抽搐等）。在美国和欧盟，估计每年有50,000-70，000只小鼠用于狂犬病疫苗的效力检定和签发。
1.2.1. 人用狂犬病疫苗效力检定实验的要求
Robin Levis 博士（FDA， 美国）回顾了当前美国人用狂犬病疫苗的效力检定要求。美国联邦法规（CFR）对人用狂犬病疫苗效力的确定没有规定具体的检定方法。文件21 CFR610.10声明：“效力试验包括体外或体内试验，或两者兼用，是针对每个产品专门设计，能够以适当的方式明确显示其效力。所有在美国许可生产人用狂犬病疫苗的厂家坚持世界卫生组织（WHO）的指导方针，效力定义为两次有效的NIH测试的几何平均数，规定效力必须显示出与临床效果的关联。效价大于2.5 IU /剂的狂犬病疫苗可确保临床效力，能使血清中和抗体的滴度至少相当于0.5 IU / ml，定义此数值标志着可获得抵御疾病和死亡的保护。美国FDA已采纳了使用较早的人道终结点指征（如瘫痪、麻痹、抽搐），只要适用，就积极鼓励实施[Robin Levis，美国FDA，个人通信]。
尽管欧洲制造商经常重复进行2次效力检定，以满足欧洲以外疫苗进口国的要求，欧洲药典（Ph. Eur）并没有规定NIH实验所需要的重复次数。较早的人道终结点的使用已被明确界定和采用。
Sunil Gairola博士（印度血清研究所）报告说，在提交稳定有效的小鼠攻击试验数据和稳定的实时动态测试参数的情况下, 印度监管当局允许疫苗生产商使用单次小鼠效力攻击实验的数据。
正如Jinho Shin博士（WHO，瑞士）所解释的，WHO指南规定，所有批准供人类使用的狂犬病疫苗定义其效力应该是两次有效的效力试验的几何平均数。为了在整个保质期维持临床的最低效力，WHO建议每一批人用狂犬病疫苗的效力基于与国际参比制剂的比较应超过2.5 IU/剂。简单地说，狂犬病疫苗的国际标准品（IS）用于在小鼠效力攻击实验和测定糖蛋白含量的体外实验中狂犬病疫苗的标准化。 标准品从一批Vero细胞来源的Pitman Moore 株原液中制备，制造采用与第五批国际标准品(RAV)一样的制造程序。参照第五批国际标准品，由来自10个国家的16名参与者的一项合作研究把候选标准品的效价用国际单位表示。在用于小鼠效力攻击实验时，标定的单位含量是8 IU /安瓿（亦即8 IU / ml）。
1.2.2. 兽用狂犬病疫苗的检定要求
Donna Gatewood博士（美国农业部，美国）简要介绍了目前在美国兽用狂犬病疫苗效力检定中在按减少、优化和取代 (3Rs) 原则选择替代方法时，在产品特异的验证方面的要求和指南。 美国农业部目前要求采用有效的NIH实验以证明所有批签发的兽用狂犬病疫苗的效力。美国农业部为一次有效的相对效力实验规定了一个必须达到的最低要求：接受最高浓度兽用狂犬病参考疫苗稀释液（VRRV）的小鼠必须至少有70％（11/16）生存，接受最低浓度兽用狂犬病参考疫苗和测试疫苗稀释液（VRRV）的小鼠至少有70％（11/16）必须死亡; 标准攻击病毒（CVS）回复滴定必须证明被注射的滴度在12-50 个LD50之间。如果初始试验未能满足最低的相对效力的测试要求，必需增加两次实验，将所有3项试验的几何平均值用于评估相对效力。来自美国和国际机构的演讲嘉宾指出，他们认识到，虽然当前狂犬病疫苗小鼠攻击试验能确保检出低效力疫苗，他们希望看到科学有效的替代方法的实施。Gatewood强调，实施任何兽用灭活疫苗体外替代方法将需要监管机构和制造商密切的伙伴关系，要考虑到检测参比盘(panels)的使用，并依赖于生产方法的一致性。
Lukas Bruckner博士（IVI，瑞士）解释了最近以血清中和试验分析（SNT）作为兽用狂犬病灭活疫苗效力检定所进行的国际实验室间的一次成功的合作研究，并建议纳入欧洲药典专著0451，以取代NIH试验。在最近的2012年4月第142届会议上，欧洲药典委员会接受SNT法用于兽用狂犬病疫苗检定。
[ Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005 邱 松译 严家新校 ]
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