武汉生物制品研究所狂犬病检测中心RFFIT技术建立的历程： 

     1995年6月，法国巴斯德研究所狂犬病研究室（WHO狂犬病参考与合作中心）前主任蒋安立（Herry Tsiang）博士专程访问本所，进行学术交流。双方达成在狂犬病毒研究方面进行全面合作的意向。蒋安立博士最早明确提出：在中国要解决狂犬病的防治问题，首先要解决的问题之一就是要建立狂犬病检测中心，而且中国至少要建立4个（分别设在国家CDC、药品检定所、相关产品的生产厂家和兽医部门）。

1996年2月，受蒋安立博士之邀，我室的严家新研究员去法国巴斯德研究院学习狂犬病毒抗原和抗体的检测技术，带回了蒋安立博士赠予的许多资料和实验材料。

1996年3月，蒋安立博士再次专程访问我所。此后十余年里，蒋安立博士每年都要访问中国；其接班人 Bourhy 博士也多次访问中国，与我所共同开展狂犬病毒的分子流行病学及相关诊断试剂的研究，协助我所建立符合WHO标准的狂犬病检测中心，共同培养博士研究生，共同向欧共体等机构申请科研课题经费等。

1996年当年，本室就用自行研制的多株抗N单克隆抗体混合制备出了荧光标记抗体，在国内首次建立了RFFIT检测抗体的方法。相关结果曾在1997年的全国性学术会议上报告。1998年初，在中国生物制品学杂志正式发表了相关论文（见下文）。该论文的结果再次证明RFFIT的重复性、特异性和灵敏度都不低于MNT(小鼠中和试验)，同时具有更加快速、价廉、简便等优点，在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可取代MNT。

1998年10月，由PRA（中法先进研究计划）支持、由蒋安立和Bourhy博士发起并组织的中法狂犬病诊断和控制培训班成功地在中国CDC传染病所（北京）举办（唐青主持）。我所的严家新和徐葛林参加了这次培训班。我所还将几种狂犬病检测试剂在培训班上进行了试用，与国外产品比较的结果证明效果很好。

本室产品曾四次送到法国巴斯德研究所WHO狂犬病参考与合作中心试用，结果特异性和敏感性都优于国外同类产品。在国内数次全国性狂犬病研讨会和学习班上，我们建立的方法和制备的试剂都获得了好评，在与国外试剂的大量现场对比试验中都证明效果相同或更好，而成本则大幅度降低。多年来，法国巴斯德研究所不仅大量购买我们生产的检测试剂盒，还多次购买我们的单抗(原材料)用于相关研究。我室制备的狂犬病毒检测试剂先后出口到法国、突尼斯、希腊、伊朗等国用于狂犬病实验室诊断，据用户反馈信息，我们的产品检测灵敏度优于国外同类试剂。

关于RFFIT基本原理的主要中文参考文献（原文发表在中国生物制品杂志，1998年第11卷第2期93－96页）

论文题目：检测狂犬病毒中和抗体的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)方法的建立 

作者：严家新 李承平 朱家鸿 曹瑞瑶薛红钢 刘碧芬 徐葛林

作者单位：卫生部武汉生物制品研究所，武汉 430060 

提 要  在国内首先制备出抗狂犬病毒(RV)核蛋白(NP)荧光标记抗体的基础上，建立起检测RV中和抗体的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)方法，经与小鼠中和试验(MNT)比较，其重复性、特异性和灵敏度均无显著差异。该方法在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可取代MNT。

关键词   狂犬病毒中和抗体  细胞培养狂犬病毒的快速滴定  快速荧光灶抑制试验(RFFIT) 

狂犬病目前在中国和许多发展中国家仍是一个严重问题^[1-3]，因而迫切需要建立和推广与狂犬病毒(RV)有关的各种快速、实用的检测方法。WHO专家委员会肯定并推荐将小鼠中和试验(MNT)和RFFIT作为检测RV中和抗体的两项基本方法^[4]，并建议在可能时尽量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、价廉，且灵敏度与MNT相同。进行RFFIT需要有抗RV核蛋白(NP)荧光标记抗体。我们在国内首先试制成功此关键试剂^[5]的基础上，建立起微量RFFIT方法，并对该方法的重复性、特异性和灵敏度与MNT进行了比较。该方法有希望在狂犬病的临床诊断、疫苗质量控制和流行病学调查等项工作中获得广泛应用。现将有关实验的结果报告如下。 

材料和方法

    1. 细胞、病毒和血清

    BHK21/BSR细胞，已适应该细胞系的RV攻击病毒CVS株(ATCC VR 959)，以及已知中和滴度(IU/ml)的抗RV标准血清(批号I-1995-10-11)由法国巴斯德研究所 Herry Tsiang 博士惠赠；接种RV疫苗(法国巴斯德梅里厄血清疫苗公司生产的VERORAB或本所生产的RV疫苗)前后的人血清由本室肖鼎昌医生提供。

    2.主要试剂和仪器

    细胞培养基: D-MEM, GibcoBRL 产品。Lab-Tak 细胞培养载玻片，Nunc 产品。Falcon 96孔平底细胞培养板。Opton 荧光显微镜。抗RV NP 荧光标记抗体：参考标准品为法国巴斯德Sanofi诊断用品公司产品(批号6E 022U)，本文中简称pNF；本室自制的相应产品，本文中简称mNF, 见文献[5]；本文中未注明采用pNF的，均采用mNF。

    3.细胞培养RV的快速滴定和最适攻击病毒剂量的确定

    组织培养RV的快速滴定按文献[5-6]， 待测RV样品经系列稀释后感染BSR细胞，细胞质内的包涵体(主要成分为RV的NP)的荧光可在24小时(固定毒)或48小时(街毒)后检测到。通常在低倍显微镜(160X)下检查20个视野(用Lab-Tak 载玻片时)，或8个视野(微量法，用96孔细胞培养板时)。滴度用 Reed & Muench 方法计算，用荧光灶单位(FFU/ml)表示。进行RFFIT时攻击病毒采用CVS株，病毒的最适攻击剂量为经24小时温育后能使80%的细胞感染(产生荧光包含体)的最高稀释度。

    4. 快速荧光灶抑制试验(RFFIT)^[5－7]

     将固定量的CVS病毒与系列稀释的待测血清(包括已知滴度的参考血清)一起温育(体外中和反应)，然后加入敏感细胞(BSR)悬液。经24小时温育后,细胞单层用丙酮固定,用荧光标记的抗NP抗体染色,以检测未被中和的病毒的存在(荧光灶)。与病毒对照组比较, 计算每种待测血清使固定量CVS病毒的FFU/ml 减少50% 的稀释度，然后与 已知滴度的参考血清比较，计算每种待测血清的中和抗体滴度。

5.RV在小鼠中的毒力测定和小鼠中和试验(MNT)，参见文献[8]。 

结果

    1. RV(CVS株)毒力参考标准品滴度的标定和攻击病毒最适剂量的确定：

将同一份CVS毒种分装保存于一70℃，在半年时间内6次重复用mNF和pNF平行测定其滴度，所得的结果相当稳定，相互间也无差别（对于病毒稀释度 1：10^3.5， t=0.445，P>0.05；对于病毒稀释度 1：10^4.2，

t=0.353，P>0.05，见表1）。此CVS毒种经测定在小鼠中的毒力滴度为5.5 LogLD₅₀/ml (Sm=0.4 Log LD₅₀/ml),可用作毒力参考标准品以换算未知样品在小鼠中的毒力滴度(根据未知RV样品与此参考样品在组织培养中用荧光灶单位(FFU/ml)表示的滴度的比值，可直接换算出其小鼠LD₅₀滴度)。此CVS毒力参考品经24小时温育后能使80%的BSR细胞感染的最高稀释度为1：160，此稀释度即用作RFFIT的最适病毒攻击剂量。  

表1. 采用mNF和pNF快速测定RV参考标准品感染滴度时荧光灶数目的重复性

Table 1. Variation in the numbers of fluorescing foci in rapid titration of RV reference samples using mNF and pNF

    2.抗RV参考血清样品效价的标定

    以法国巴斯德研究所提供的抗RV标准血清为参照，分别用RFFIT和MNT各4次重复测定参考血清A和B的中和滴度，结果见表2，这两种方法检测的结果间的差别均无显著意义(对于样品A，t=0。444，P>0.05；对于样品B，t=0。768，P>0.05,)，即可认为两种方法所得结果基本一致。

表2.用MNT和RFFIT测定2种抗RV中和血清参考品的结果

Table 2. Results of the MNT and RFFIT performed on two reference samples of antirabies neutralizing sera.

    3. RFFIT 用于监测狂犬病疫苗接种后的免疫效果(与MNT的比较):

     对接种RV疫苗前后的人血清样品52份，分别用RFFIT (平行采用mNF和pNF)和MNT 测定其RV中和滴度(仅测定样品的中和效价是否大于0.5IU/ml)。在进行RFFIT测定时，采用mNF和pNF所得荧光抗体滴度之间的符合率(52/52)为100%，而RFFIT与MNT之间的符合率（51/52）则在98%以上,其中不相符的一份样品MNT定为阴性，经RFFIT复测滴度稍大于临界值(0.5IU/ml)，为弱阳性（见表3）；这也说明RFFIT的灵敏度可能略高于MNT。

表3. 用RFFIT 和MNT 测定的52份人血清RV中和滴度的比较

Table 3. Comparison of the RV-neutralization titers of 52 human serum samples determined by the RFFIT and MNT.

Note: The RV-neutralization titers over 0.5IU/ml was considered as positive(+).

     同时用RFFIT和MNT对18份在不同时间采集自暴露后接种VERORAB疫苗者(编号37和45)或接种本所生产的RV疫苗者(编号121)血清样品的RV中和抗体滴度进行检测，结果用RFFIT和MNT测定同一份血清的滴度基本上是一致的，与相应的算术平均值相比较，绝大多数结果的变异范围都在25% 以内（见表4）。

表4.用RFFIT和MNT确定的代表性抗体的滴度

Table 4. Representative antibody titers determined by RFFIT and MNT

讨论 

本室制备的mNF成本低廉，效果稳定，在上述应用试验中都与法国巴斯德Sanofi诊断用品公司相应产品pNF的特异性和敏感性完全相同，在法国巴斯德研究所WHO 狂犬病参考与合作中心对这两种试剂进行的对比试验也得到相同结果(H.Tsiang,个人通讯）。

在应用抗NP荧光标记抗体的基础上建立的RFFIT方法，其原理和所得结果与MNT有高度的一致性(它们所专一检测的都是特异性地针对RV的保护性中和抗体)，而且比MNT更加快速(实验所需时间由14天降至2个工作日)、价廉，重复性更好，因此得到WHO的肯定和推荐^[4]，在国际上已成为最广泛接受的对MNT的替代方法。

    Fitzgerald 等^[8]曾进行3个实验室的合作研究以比较MNT和RFFIT的重复性。在同一实验室对同一样品进行检测，采用MNT所得结果的变异范围为67%-149%，采用RFFIT的变异范围为68%-146%。本文中分别用RFFIT和MNT各4次重复测定参考血清A和B的中和滴度，采用MNT所得结果的变异范围对样品A和B分别为81%-123% 和78%-129%，采用RFFIT 所得结果对样品A和B的变异范围分别为83%-120% 和86%-116%。结果都证明RFFIT的重复性不低于MNT，而且这两种方法检测的结果间的差别均无显著意义。

    Zalan 等^{[ 9]}将RFFIT方法微量化，即用96孔细胞培养板代替价格昂贵的Lab-Tak 细胞培养载玻片。其优点是可同时处理大量样品，大大减少了试剂用量，而且观察结果容易并能减少判定上的误差。本文的结果也证明这种微量化方法优点更多，值得推广。

综上所述，本文的结果再次证明RFFIT的重复性、特异性和灵敏度都不低于MNT，同时具有更加快速、价廉、简便等优点，在大多数需要检测RV中和抗体的情况下RFFIT可代替MNT，有希望在我国狂犬病的防治和研究中获得广泛应用。

参考文献 

1. 林放涛，于恩庶，朱家鸿，等.《 狂犬病学》，福州：福建科学技术出版社，1992，P1.

2. 严家新. 狂犬病流行简史，中华医史杂志，1994（4）：196-199

3. 严家新，朱家鸿. 狂犬病毒分子流行病学研究进展, 国外医学(病毒学分册), 1995, 2(2): 34-37.

4. WHO. WHO Expert Committee on Rabies, Eight Report, Geneva,WHO,1992,1.

5. 严家新,李承平,徐葛林,等. 抗狂犬病毒核蛋白荧光标记抗体的制备和初步应用,《第四次全国生物制品学术会议论文汇编》，武汉，1997，P110。

6. Bourhy H, Sureau P. Laboratory Methods for Rabies Diagnosis, Paris, Pasteur Institute,1990, P153.

7. 中华人民共和国卫生部.《中国生物制品规程(一部，一九九五年版)》，北京：中国人口出版社，1996，P201.

8. Fitzgerald EA, Cabasso VJ, Smith JS,et al. A collaborative study on the testing of rabies immune globulin(human)by the mouse neutralization test(MNT) and the rapid fluorescent focus inhibition test(RFFIT).J Biol Stand, 1979,7(1):67.

9. Zalan E, Wilson C, Pukitis D. A microtest for the quantitation of rabies virus neutralizing antibodies. J Biol Stand, 1979, 7(3):213. 

Establishment of the Rapid Fluorescence Focus Inhibition Test(RFFIT) for the Quantitation of Rabies Virus Neutralizing Antibodies 

Yan Jiaxin,  Li Chengping,  Zhu Jiahong, et al(Wuhan Institute of Biological Products, Wuhan 430060) 

    Abstract  Based on the preparation of the fluorescein-labeled antibodies to rabies virus(RV) nucleoprotein(NP),the rapid fluorescence focus inhibition test(RFFIT) for the quantitation of rabies virus neutralizing antibodies was established and its  reproducibilty, specificity and sensitivity were compared with the mice neutralization test(MNT). This method could replace MNT in most case of quantitation of RV neutralizing antibodies and it would be used widely in the research on RV and the prevention and treatment of rabies in China.

    Key words 　 Rabies virus nucleoprotein      Rapid titration of rabies virus in cell cultures    Rapid Fluorescence Focus Inhibition Test(RFFIT)