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摘要

虽然狂犬病疫苗的应用已经有一个多世纪的历史，但是狂犬病疫苗通过免疫接种或天然感染后引起机体免疫应答的具体机制仍不太清楚。本研究通过减少灭活和减毒活疫苗剂量，分别采用常规、提前或延迟的处治方案来比较所产生的不同保护效果。分别对2月龄叙利亚地鼠、4周龄ICR小鼠或成年猕猴接种犬狂犬病毒（RV）变种。在暴露后6小时、1、2、3、4、5、6和7天开始处治。应用单剂或多剂灭活疫苗（HDCV）、反向遗传技术构建的减毒活疫苗或γ射线灭活的ERAG333疫苗进行肌肉接种。对病毒在这些啮齿类动物模型中的传播动力学进行监测。结果发现， RV在感染4天后播散到脊髓，6天到达脑部。在暴露后迟至5－6天才接种ERAG333活疫苗的地鼠全部死亡。而在6小时、1、2、3和4天分别接种一个剂量的ERAG333活疫苗的存活率分别是78%，44%，56%，22%和22%。与此相似，在暴露后24小时接种灭活ERAG333疫苗，地鼠存活率是67%。如果标准预防方案――埃森(Essen)方案推迟3-6天才执行，则所有的地鼠全部死亡，而暴露后1-2天即开始进行预防的地鼠的存活率分别是67%和33%。猕猴在暴露后24小时接种一剂减毒的ERAG333疫苗即可获得保护力。即使预防延迟，高度减毒（活的）和灭活的ERAG333疫苗也可诱导强有力的保护性免疫反应。按照埃森方案，采用2-5剂商品疫苗和人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）进行预防，实验动物的存活率可达89-100%。经缩减的疫苗接种程序仍可以提供有效的预防，接种疫苗的剂量总数不影响结果。

1. 引言

狂犬病一旦发病就会致命，但是如果能够尽早采取适当的暴露后预防（PEP），完全可以避免疾病发生。到目前为止，还没有单独的任何一种药物具有特异性的治疗效果，但是联合采用不同生物制剂的治疗方案可发挥协同作用，已成功地应用于实验性治疗。目前，PEP仍是在暴露后唯一有效的预防人类狂犬病的方法。

现代的PEP主要包括被动免疫和主动免疫，被动免疫是早期输入针对狂犬病毒（RV）的中和性抗体，这些抗体是由病毒的有效成分刺激产生的；而经诱导产生的主动免疫则可进一步清除外周组织的病毒。在接种的疫苗能产生主动免疫应答之前，被动输入免疫球蛋白所提供的病毒中和抗体(VNAs)可以填补机体抵抗力暂时的空缺，这是PEP的一个重要组成部分，特别是对于严重的暴露。以往的实验表明，体液免疫对清除外周RV作用很大，而细胞免疫应答则作用有限。PEP一方面可以快速诱导免疫应答，还可以使机体产生持续的免疫记忆，这是PEP的另一个重要作用。

   在过去的一个世纪中，狂犬病疫苗生产所用的基质、减毒和灭活的水平和方式，以及接种途径都发生了巨大变化。同时，由于疫苗免疫原性、有效性和安全性的提高，PEP经肌肉途径接种疫苗的剂量从原来的21剂以上逐渐减少到现在的4剂。关于未来的疫苗产品，亚单位、DNA和重组活疫苗都正处在实验评估阶段。

尽管狂犬病生物制品的生产在全球已得到改进，对狂犬疫苗的免疫原性和有效性的认识也在不断进步，但其实际应用仍受到经济和技术的制约。在21世纪，某些国家仍在生产神经组织疫苗，并用作暴露于疯动物后唯一的预防手段。而且，尽管针对狂犬病的成功的疫苗接种已有一个多世纪的历史，但在自然感染或接种灭活或减毒活疫苗所引起早期的细胞和体液免疫的分子机制仍不清楚。      

本研究目的是在不同动物模型中，对各种灭活和减毒狂犬病疫苗及PEP程序的预防效果进行实验比较。

2.材料与方法

2.1.动物与病毒

2 月龄雌性叙利亚地鼠（金仓鼠）、4 周龄雌性ICR小鼠，在实验前至少观察72小时。1 岁龄雌性猕猴，实验前至少经2 个月检疫。

为了便于对比，选用两种不同的犬街毒株作为攻击毒株。其中一株滴度为10(2.5 次方)MICLD50/50μl，分离自德克萨斯州一只自然感染狗的唾液腺；另一株滴度为10(2 次方)MICLD50/50μl，分离自墨西哥一只自然感染狗的唾液腺。

所有的实验动物的处理及实验程序都是符合疾病预防与控制中心关于动物管理和操作委员会的指导方针。

2.2.　生物制品

对于啮齿类动物，根据实验设计方案一次性接种最低效价为2.5 IU/ml的50μl（非人灵长类动物1ml）HDCV ，Imovax®(sanofi pasteur)或50μl 纯化的鸡胚疫苗(PCEC)，Rabavert (Novartis)。同样地，对于啮齿类动物，根据PEP的原则，在相应部位肌肉注射50μl未经稀释的HRIG，HyperRabtm S/D (Talecris Biotherapeutics, 150 IU/ml)或Imogam®Rabies-HT (sanofi pasteur, 150 IU/ml) 。

减毒疫苗ERAG333（通过定点突变的方法将病毒G蛋白333位点的精氨酸突变为谷氨酸）和ERA2G333（含有两个G基因，333位点都突变）通过反向遗传系统构建。ERAG333株显示出高度的安全性，对3 周龄的成年小鼠及其他目标或非目标物种均无致病性，甚至经颅内注射也是如此。经γ 射线灭活的ERAG333株，将灭活病毒样品在鼠神经瘤细胞（MNA）中连续传3代以验证完全灭活的病毒。将减毒或灭活的ERAG333株50μl (10(9次方) TCID50/ml)肌肉接种于仓鼠或小鼠右腓肠肌或接种1ml于猕猴三角肌(10(9次方) TCID50/ml)。

2.3. 实验方法

2.3.1.　 直接荧光抗体试验 (DFA)

   采用异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体检测脑组织样本中的狂犬病毒抗原。

2.3.2 .　逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)及半嵌套式RT-PCR (hnRT-PCR)

   采用RT-PCR和hnRT-PCR方法追踪检测RV从地鼠的接种部位到达脑部的过程。采集腰部、胸部脊髓及脑部切片组织，应用无菌技术以防止交叉污染，按照TRIzol Reagent（Invitrogen）说明书进行操作提取组织总RNA。逆转录的引物为1066fw （5’ GAG AGA AGA TTC TTC AGG GA 3’ ），引物根据RV PV株基因组（登录号M13215）1136nt–1155nt处的序列设计，反应条件为42℃ 90 min。第一次PCR采用引物1066fw和304rv（3’TTG ACA AAG ATC TTG CTC AT 5’）扩增病毒基因组从304nt–1066nt的一段序列。另设计两条引物通过hnRT-PCR检测微量的病毒RNA：(a) 1087fw (5’ GAG AAR GAA CTT CAR GA3'， 1087–1104) 和304rv；(b) 504sfw（5’TCA TGA TGA ATG GAG GT 3’ ，504–521）和304rv。两次PCR反应条件一致： 94 ◦C预变性1 min，40 个循环 ：94 ◦C 30s，37◦C 30s，72◦C 1.5 min， 最后72 ◦C 延伸7min，采用3.5%琼脂糖凝胶的方法检测扩增片段大小，然后通过序列分析鉴定病毒。

2.3.3.　 快速荧光灶抑制试验 (RFFIT)

采用RFFIT方法利用CVS-11作为攻击毒株检测病毒中和抗体（VNA）。

2.3.4 .　统计学分析

统计并绘制Kaplan–Meier生存曲线(SAS 9.2)，采用时序检验法(log-rank test)分析各个实验组的生存量差异。同一生存函数的检验假设在P < 0.05时被否定。

2.4.　 应用灭活的商用HDCV和减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333对地鼠进行PEP

2.4.1  利用分离于德克萨斯狗的RV进行攻击实验

将分离于德克萨斯狗的RV(10(2.5次方)MICLD50/50μl )肌肉接种于2 月龄雌性叙利亚地鼠(6只/组)左腓肠肌。实验动物根据不同的PEP方案被分为若干组，每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 灭活的HDCV或减毒疫苗ERAG333或ERA2G333。接种HDCV的实验组，于0, 3, 7, 14和28天 各接种一剂 （同时注射或不注射HRIG）；接种减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333的实验组，每只动物只接种一次，分别于暴露后1、3、5或7天；对照组6 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。

2.4.2.  利用分离于墨西哥狗RV进行攻击实验

将2月龄雌性叙利亚地鼠分为13组（9只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl (10(2次方)MICLD50/50μl ) 分离于墨西哥的狗RV。然后，应用减毒的ERAG333疫苗在6小时、24小时和2、3 、4、5、6天 对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。埃森方案规定于暴露后0、3、 7、 14和28天 各接种一剂 HDCV疫苗或同时注射HRIG。对照组9 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。

收集各个实验组动物腰部、胸部脊髓和脑组织并用hnRT-PCR检测病毒RNA。同时，每日观察动物情况，连续观察4 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.5.　 应用减毒和灭活的ERAG333疫苗对地鼠进行PEP

将2月龄雌性地鼠分为5组（6只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl （10(2次方) MIC LD50/50μl）分离于墨西哥狗的RV。然后，应用减毒或灭活的ERAG333疫苗在24小时 和3 天对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。每日观察动物情况，连续观察2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.6.　 应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的ERAG333疫苗对猕猴进行PEP

将成年雌性猕猴分为3组（3只/组），每只猕猴经咀嚼肌注射0.5ml 滴度为10(2次方) MIC LD50/50μl分离于墨西哥狗的RV。24小时后，第一组于三角肌接种1ml HDCV(根据埃森方案于0, 3, 7, 14和28天 各一剂 ，不包括HRIG）；第二组于三角肌接种一次1ml 减毒ERAG333疫苗（10(9次方)TCID50/ml）(于3, 7, 14和28天 在三角肌接种1ml PBS）；第三组只在0, 3, 7, 14和28天于三角肌接种1ml 的PBS。所有动物在第1 个月每周采一次血检测VNA，1 个月后继续每日至少观察动物两次，连续观察3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.7.　 在地鼠模型中检测早期和延迟进行标准PEP（5剂疫苗）的有效性

将地鼠分为6组（3只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 滴度为10(2.5次方)  MIC LD50/50μl分离于德克萨斯狗的RV。根据埃森方案，应用灭活的疫苗（PCEC）和免疫球蛋白于1、2、3、4、5和6天进行PEP，对照组不进行任何处理。每日观察动物情况，连续观察3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.8.　 在地鼠模型或ICR小鼠中检测不同剂量疫苗PEP的有效性

将两月龄叙利亚地鼠或ICR小鼠分为8组（9-10只/组），每只小鼠经左腓肠肌注射50μl 滴度为10(2次方)MIC LD50/50μl分离于墨西哥狗的RV。根据埃森方案，应用灭活的疫苗（HDCV）和HRIG于24小时 进行PEP，第一组免疫5 次（0, 3, 7, 14和28天），第二组4 次（0, 3, 7,和14天），第三组3 次（0, 3,和7天），第四组2 次（0和3天），第五组1 次（0天）。每日观察动物情况，连续观察2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

3. 结果

3.1. 应用灭活的商用HDCV和减毒ERAG333或ERA2G333疫苗对地鼠进行PEP

3.1.1  利用分离于德克萨斯的狗RV进行攻击实验

对照组的动物和仅接种灭活HDCV的地鼠全部发病，与何时开始PEP无关。在经11-15天的潜伏期出现狂犬病症状后执行安乐死，检测发现：病毒于第4天播散到实验动物的腰部脊髓，第6天到达脑部。于第7天接种减毒疫苗ERAG333以及第5或7天接种减毒疫苗ERA2G333的地鼠全部死亡。然而，暴露后第1或3天接种1个剂量减毒疫苗ERA2G333的地鼠存活率为50%。与此类似，暴露后第5、3、1天接种减毒疫苗ERAG333的实验组中分别有17%、33%和83%的地鼠存活。在对照组与接种HDCV 、ERAG333或ERA2G333疫苗的实验组之间，病毒的潜伏期无差异。

3.1.2.  利用分离于墨西哥狗的RV进行攻击实验

仅接种HDCV或感染后第5或6天只接种减毒疫苗ERAG333的地鼠全部死亡。然而，暴露后第6小时、1、2、3或4天接种一剂 减毒疫苗ERAG333的地鼠存活率分别为78%（7/9）、44%（4/9）、56%（5/9）、22%（2/9）和22%（2/9）。通过比较发现，根据标准PEP方案进行预防或仅注射HRIG的动物有44%（4/9）存活。对照组（只用病毒攻击，没有采取PEP）中仅有一只地鼠存活（1/6），检测发现病毒于暴露后第4天播散到动物的腰部脊髓，第6天到达脑部。

3.2. 应用减毒或经γ 射线灭活的ERAG333疫苗对地鼠进行PEP

在暴露后24小时接种减毒ERAG333株的地鼠全部存活（6/6）；于暴露后第3天接种一剂相同疫苗的只有50%存活。在暴露后24小时接种灭活ERAG333株的地鼠有4只存活（4/6），存活率为67%；于暴露后第3天接种相同灭活疫苗的存活率只有20%（1/5）。仅接种PBS的对照组中，地鼠存活率为33%（2/6）。

3.3. 应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的ERAG333疫苗对猕猴进行PEP

实验前，在本组实验动物中未检出VNAs。对照组发病动物执行安乐死后，采用DFA均在脑部组织检测到RV抗原。接种5 剂 HDCV（没有接种HRIG）的实验组有2 只猕猴存活（2/3）。而暴露后24小时仅接种一剂减毒ERAG333疫苗的猕猴全部存活。两个疫苗免疫组中动物的VNA水平相差无几，在14-28天到达顶峰，并逐渐降低直至免疫后第90天。

3.4. 在地鼠模型中检测早期和延迟标准PEP（5剂 剂量）的有效性

于第3、4、5和6天开始进行灭活疫苗（PCEC）加免疫球蛋白的PEP实验组中，所有的地鼠都死于狂犬病，而暴露后第1和2 天进行PEP的实验组存活率分别为67%和33%。

3.5.　在地鼠和小鼠模型中检测不同剂量疫苗进行标准PEP的有效性

在对照组中（PBS处理），78%（7/9）的地鼠死于狂犬病；按照埃森方案接种5剂 HDCV疫苗（没有接种HRIG）的实验组中，有89%（8/9）的地鼠死亡。而根据修订的埃森方案接种1、2、3、4和5剂 疫苗和HRIG的实验组中，地鼠的存活率分别为67% (6/9)，89%(8/9)，78% (7/9)，100% (9/9)，78% (7/9) 和78% (7/9)。与此类似，在接种1，2，3和4 剂 HDCV疫苗和HRIG的小鼠实验组中，其存活率分别为80% (8/10)，90%(9/10)，90%(9/10)和70% (7/10)。对照组动物全部死亡。

4. 讨论与结论

暴露于某个特定RV后的结果与该RV的基因型或是否存在变异体，以及其致病性（致凋亡力、神经侵袭性）、病毒的感染剂量、感染途径和严重程度、宿主种类及其对病毒的易感性等都有一定的关系。这些因素与宿主的固有和适应性免疫应答一起决定着病毒感染的最终结果。PEP的目的是快速刺激宿主免疫应答，并介导宿主在早期对病毒的中和和清除。不同的免疫方法可以刺激固有或适应性免疫应答的不同分支部分。

由于中枢和外周神经系统具有免疫学方面的某些特权而且对早期的病毒识别能力有限，所以外周非神经组织中的病毒中和作用在清除RV的过程中起到非常重要的作用，也是PEP成功的关键。

致病性的RV通过限制复制水平从而降低糖蛋白的表达、抑制干扰素反应、抗细胞凋亡刺激和单一的沿神经传播方式等特别机制来逃避外周免疫系统的早期识别。

病毒颗粒一旦进入外周神经系统就开始向中枢神经系统（CNS）传播，该病的致命性后果就不可避免。鉴于RV病理学的特殊性，越早开始合理的PEP，治疗的效果越好。然而，病毒的潜伏期及从感染到成功进行PEP的间隔时间是不同的，取决于RV的基因型/是否存在变异体、及其对特定宿主的致病性、病毒的感染量、感染的途径及严重程度。

在啮齿动物模型中发现，病毒可能进入肌肉细胞并在入侵部位增殖，或直接进入外周神经而不预先在非神经组织增殖。大量研究表明，RV首先侵入外周神经元的运动和/或感觉神经的轴突并沿轴突以50–200mm/天的速度逆行至CNS。我们研究发现，两种不同RV变异株在地鼠模型中的逆行传播速度为15–30mm/天。如果病毒只是“被动地”传播，仅依赖于沿轴突转运固有的速度，那么不同的宿主种类以及其他实验因素的不同可以用来解释当前的发现与以往研究结果的不同。

RV侵入外周和CNS后不断地适应和逃避免疫系统的反应，尽量促进自身的存活。病毒在不同的宿主内具有不同的致病性，所引起的免疫应答强度也存在差异。一旦RV侵入神经元，便有可能发生经典的中和作用，但发生的几率很小。早期的PEP使用免疫球蛋白，并用灭活的疫苗诱导体液免疫，随后可中和外周非神经组织中的病毒，这是在发病前清除病毒的主要机制。

如果缺失了B细胞和T细胞，或仅缺失B细胞，小鼠在经鼻感染减毒的CVS-F3 RV后会发展成为进行性疾病并死于狂犬病。然而将缺失了CD8+T细胞、IFN受体或补体C3和C4的小鼠与相应功能正常的小鼠进行比较，结果存活率无显著差异，这表明细胞免疫在清除RV过程中起到的作用较小。其他研究也显示，免疫功能正常的小鼠，而不是B细胞有缺陷或缺失了IFN-I、TLR或IL-1受体信号通路的小鼠，在经颅内感染致病性的DOG4 RV和减毒SPBAAN-GAS-GAS-GAS  RV的混合物后，仍然能够存活。

目前，所有人用细胞培养商品疫苗都是基于灭活的RV。疫苗中的病毒抗原可以激活CD4+辅助性T细胞反应，随后通过MHC-II机制（主要针对病毒糖蛋白）激活B细胞体液反应，产生VNA。正如在我们的“严重暴露”实验中所显示的，暴露后被动和主动免疫的时间非常关键，延迟PEP开始时间将会增加疾病的死亡率，如果推迟3天甚至更晚才进行预防接种，可能会完全没有保护作用。显然，暴露后尽早开始PEP是成功的关键。

我们的结果表明，被动免疫以及VNAs在病毒的清除过程中非常重要：早期开始的PEP即使接种了5 剂灭活疫苗，攻击后的动物仍全部死亡。相反，如果PEP只包括HRIG，或包括HRIG加灭活疫苗，则60%-100%的实验动物存活。

灭活疫苗可以激活B细胞并通过MHC-II机制激活CD4+ T细胞，而重组DNA和减毒活疫苗除了可以激活CD4+ T细胞和B细胞外，还可以激活CD8+ 细胞毒T细胞。后者在狂犬病PEP中的作用尚未得到充分研究。

在啮齿类和非人灵长类动物模型中，与接种灭活商品疫苗相比，仅接种一剂减毒ERAG333疫苗在引起体液免疫反应的效果上并无差异（前7天检测不到VNAs），这说明细胞免疫、趋化因子、细胞因子以及固有免疫在外周非神经组织的狂犬病毒清除中具有重要作用。我们发现减毒活疫苗可以有效地保护感染的动物，即使是在暴露后3-5天仅接种一剂疫苗，此时已经可以在动物的腰部和胸部脊髓检测到病毒RNA，这进一步表明存在可以从神经系统清除RV的机制。我们的结论是，高度减毒的活疫苗比灭活疫苗能诱导在质或量方面都不同的更强的免疫反应，即使是在PEP延迟开始和病毒已经在部分神经系统中分布的情况下，也可以提供保护。一个类似的报道显示，在小鼠模型中，采用致病性的DOG4 RV进行攻击后4、16、24、48 和 72 小时再肌肉注射减毒活疫苗SPBAAN-GAS-GAS-GAS，小鼠的存活率分别为100%,、90%、55%、 40% 和 30%。我们推测在CNS中已存在致病性的RV，因为实验中观察到于暴露后4小时或更晚给予PEP的小鼠中，有50%–90%出现暂时性后肢麻痹，而未感染、仅接种了疫苗的小鼠无任何临床变化。在免疫功能正常的小鼠中经颅内接种致病的和活的减毒狂犬病疫苗的混合物后，观察到100%的生存率。

我们并未详细研究后来在外周神经组织中清除RV的具体机制，但我们推测细胞介导的免疫应答联同血液-神经间屏障的改变对整个结果具有重要影响。血脑屏障（BBB）以及CNS内的免疫应答的作用以前已有详述，但是关于血脑屏障的通透性及其协助CNS在发生可检测到的脑炎之前清除病毒的准确机制目前尚不清楚。外周神经系统的神经内膜间隔由结缔组织、内皮细胞和神经内膜血管构成，被血液-神经屏障所分隔。虽然这些内皮细胞并不像脑部血管内皮细胞那样紧密连接，但他们在将外周神经与血浆组分分隔开的能力方面仅次于CNS。有趣的是，最近在脊髓根处，最远在运动神经终板处，其间的屏障效果要差一些。而且，已知T细胞经常是先移行至分隔的免疫特权器官，例如脑和外周神经，在此短暂停留，监控各种组织，然后返回至血液循环。这些研究能为中和作用和从外周神经中清除RV提供部分解释。

许多病毒的中和以及从CNS的清除都需要CD4+和CD8+ T细胞的协同作用，其中CD8+ T细胞直接提供穿孔素和IFN-γ介导的抗病毒活性。以往已有研究部分地证明，减毒活疫苗激活的免疫应答可中和RV，即使病毒已经在有限程度上进入CNS（经肌肉进行攻击后再脑内免疫接种）。我们的研究也发现，接种一剂减毒的ERAG333就可以激活免疫应答，促进清除已侵入腰部和胸部脊髓的RV。然而，如果在暴露后6天才接种减毒活疫苗ERAG333，此时RV已经复制并播散到脑部，该疫苗就不能足够快速地激活有效的免疫应答。尽管将RV从CNS中清除也可能发生，但我们的实验明确显示，当RV在CNS增殖和播散超过一定阈值，不管是什么程度或是多么强烈的免疫应答，都不能完全中和和清除病毒，并同时能维持神经细胞的完整性和保证宿主的存活。到目前为止，所有的实验治疗临床狂犬病的尝试方法包括鞘膜内注射特异性RIG、输入细胞因子或趋化因子、接种减毒的SAG2减毒活疫苗和利用各种抗病毒药物，或联合应用这些方法，结果除了一例外，全都失败了。

总结：与其他报道不同，在暴露后24小时内接种经γ射线灭活的ERAG333疫苗也可以诱导免疫应答，并保护大部分（60%）的实验动物。这说明复制并不是诱导上述免疫应答所绝对必须的。

减毒的病毒疫苗诱导相关免疫反应的潜力及其从CNS中清除RV的能力还需要在完善的动物模型中进一步研究。

在动物PEP中，尽管接种了5 剂灭活的商用疫苗，但没有同时注射免疫球蛋白，结果发现这样并不能保护感染的实验动物对抗严重的实验性病毒攻击；而联合注射免疫球蛋白和2-5剂疫苗（如果在暴露后很早就开始）就可以提供有效的保护，不必考虑使用的疫苗剂量的绝对数量。

在猕猴模型中，PEP采用灭活疫苗而不同时注射免疫球蛋白，结果出乎预料，除了一只猕猴外其他的都存活下来。这说明，物种特异的相互作用(天然的敏感性/抵抗力)在很大程度上决定于RV的致病性和宿主的免疫反应。在很多发展中国家都存在免疫球蛋白短缺，于是经常采用仅使用疫苗的PEP方案，这可能会导致死亡率增加，尤其是对于那些头部严重暴露的病例。

与其它研究不同的是，在我们的只接种疫苗的试验中，未观察到明显的“早死”现象。这可能与所选择的RV毒株、间隔时间和其他因素有关。

迄今为止，虽然在狂犬病疫苗和RV致病性的研究方面取得了很大进展，但是狂犬病的症状一旦出现仍无法治疗。所以，当前的应用研究和公共卫生政策应该着重加强以广泛分布的实验室为基础的监测项目，研发和生产高效、安全、廉价的生物制品，并为发展中国家提供一种理想的人狂犬病预防措施。发展和应用适当的动物模型作为人类的替代品非常关键，它将为不断改进狂犬病的预防措施、发展和评价实验性的狂犬病处治方案提供有用的参考依据。

[Vaccine  2009，27（51）：7149－7155　解庭波译　严家新校 ]