第三代狂犬病减毒活疫苗在家犬中的应用效果(3)

前言：

人类的狂犬病99％是由狗传播而来。为了实现全球在2030年消除经狗传播的人类狂犬病的宏伟目标，必经之路就是通过给狗普遍接种疫苗消除狗群中的狂犬病。狗群中的狂犬病消除了，人的狂犬病也自然就消除了。但要给狗特别是流浪狗通过打针接种疫苗是一项艰难而危险的工作。如果能开发出安全有效的口服（食饵）疫苗，则将带来极大的便利。口服（食饵）疫苗通常都是减毒活疫苗，欧美国家将口服减毒活疫苗用于控制多种野生动物的狂犬病，曾取得巨大的成功。但若要将口服减毒活疫苗用于家养动物狗，则在安全性方面要求更高，因为口服活疫苗用于狗以后，与人和其他各种家养动物直接接触机会更多，必须确保对人和家养动物有更高的安全系数。而且许多在野生动物中有效的口服疫苗对狗的效果大打折扣，因此迫切需要开发符合更高标准的口服疫苗用于作为家养动物的狗。世界各国包括中国在内的狂犬病研究人员多年来一直在进行适用于狗的口服狂犬病疫苗的研发工作，德国的研究人员多年在这方面处于领先地位。

在今年１月30日出版的世界最著名的疫苗学专业杂志《Vaccines》上，德国的相关研究人员发表了一篇研究论文（见参考文献），介绍第三代口服狂犬病疫苗应用于家犬的最新研究进展。

适用于狗的安全有效的新一代口服狂犬病疫苗也是中国非常迫切需要的，这篇文章的内容，包括一些实验细节，都是值得我们认真学习、参考的，所以以下分数次较详细地译介这篇研究论文的主要内容。

2.　材料和方法（1） 

2.1. 疫苗食饵

SPBN GASGAS疫苗悬液(病毒含量10^7.5 FFU/mL, 3.0 mL)被填充在由专有箔(“软泡”)制成的柔性小袋中，并嵌入鸡蛋味以明胶为基质的食饵中。SPBN GASGAS疫苗中的重组毒株来源于疫苗株SAD B19的cDNA克隆(SAD L16)。通过定点诱变，在小鼠体内观察到的亲本毒株在i.c.（颅内）接种后的残存致病性已被完全消除(糖蛋白基因中第333位氨基酸位置的氨基酸发生了替换)。此外，糖蛋白基因第194位氨基酸上的所有3个核苷酸都被替换，以避免由于该位置的代偿性突变而导致的部分毒性逆转的潜在可能性。最后，在G-基因和Ｌ-基因之间插入了第二个具有相同替换的糖蛋白基因。

2.2. 挑战（ 攻击）用病毒

为进行挑战感染实验，使用一种分离自阿塞拜疆的犬狂犬病毒分离物(FLI-Lab ID: 5989, 2004;2012年8月28日在小鼠NA细胞中第二次传代，10 ^5.3 MICLD 50 /mL) (GenBank: LN879480.1)。在之前的筛选挑战研究中，这种挑战病毒已经在不同的动物模型中进行了测试，包括狗(未发表的结果)。病毒原液的MICLD 50 /mL（效价）测定方法按常规。

2.3. 动物

总共使用了40只比格犬(Beagle)。这些动物在抵达实验场地时年龄至少有8周。性别比例为1:1。所有的狗在临床上都是健康的，这些动物都被单独标记上了应答芯片，以用于识别。监管要求规定了研究挑战阶段的最低动物数量。因此，为了防止在进行挑战感染实验前出现不可预见的损失，额外纳入了5只(备用的)动物(3只接种了疫苗，2只入对照组)。不管怎样，在最后的挑战阶段，只有25只接种疫苗的动物和10只对照动物被攻毒。

2.4. 居住条件

在到达实验场地后，直到感染，所有的动物都被安置在室外的动物围栏中。每笼内面积6 ~ 8m²，每笼外面积17 ~ 55  m²。每个笼子里都提供了狗日常生活环境浓缩的物品，如拉绳、咀嚼玩具、布和狗床。必要时，每个笼子的内外区域可以相互分开。动物按性别分组，每笼最多5只。到接种疫苗时，动物与其他动物至少隔离2-4小时，避免可能的水平传播。在作挑战（攻击）实验时，动物被从室外围栏转移到室内实验动物设施单元。动物被关在单独的笼子里(占地面积4平方米)。由于这些单元总共只可容纳20只狗，因此有必要将研究分为两部分。

动物每天喂食两次。水是充分提供的。工作人员每天至少对所有犬只进行一次一般健康状况、采食量和排便情况的观察。如果在日常动物检查中发现临床异常，则确定观察到的结果是否由于狂犬病感染，如果不是，则确定动物是否需要治疗。在出现严重临床症状的情况下，会人道地杀死狗。

治疗和取样一般在没有麻醉或镇静剂的情况下进行。仅在挑战感染和单次采血的情况下，在第一阶段使用以0.1 mg/kg体重的剂量给动物肌肉注射镇静剂美托咪啶（Medetomidine）。在研究的第二阶段，以7.5 mg/kg的剂量使用盐酸替他明（Tiletamin Hydrochloride）+盐酸唑拉西泮( Zolazepam hydrochloride）。采用甲苄噻嗪（Xylazine） (2%，2 mg/kg)和氯胺酮（Ketamine）(10%，10 mg/kg)进行安乐死诱导。对于安乐死，使用T61®(Intervet GmbH, Unterschleissheim, Germany)进行深度全身麻醉，剂量为0.3 mL/kg体重。

在实验结束时，所有在挑战中幸存下来的狗都被人道地处死，除了5只没有接受病毒攻击的备用动物。研究结束后，这些动物通过专业组织移交给新的主人。

2.5. 疫苗接种方案

狗被分为两组:第1组(n = 28,25 + 3只备用动物)接受鸡蛋味的疫苗诱饵，第2组(n = 12,10 + 2只备用动物)接受鸡蛋味的安慰剂诱饵(含装满水的小袋)。该研究分为2部分(第一阶段和第二阶段:分别有14只接种疫苗的动物和6只对照动物)。第2阶段的动物在第1阶段动物4个月后接种疫苗。这项研究采用盲法，只有接种者知道哪些动物接种了疫苗。所有其他参与的人，包括研究监督员和动物饲养员，都不知道哪个动物接受了哪种治疗。此外，所有采集的样品都是在不了解处理方法的情况下进行盲目检测。

（未完待续）

参考文献：

Bobe, K.; Ortmann, S.; Kaiser, C.; et al. Efficacy of Oral Rabies Vaccine Baits Containing SPBN GASGAS in Domestic Dogs According to International Standards. Vaccines 2023, 11, 307. https://doi.org/10.3390/vaccines11020307 

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