图解：狂犬病三种实验诊断方法的比较 

印度是全球狂犬病发病人数最多的国家。近几年印度在狂犬病的防治和研究方面都取得了显著进步。在研究方面近几年印度相关科研人员在国际上发表的狂犬病研究论文逐年增多。

以下介绍的是近期印度研究人员在国际专业杂志《The Pharma Innovation Journal（制药创新杂志）》上发表的有关狂犬病三种实验诊断方法的比较研究（见参考文献）。 

摘要

狂犬病是一种可以用多种不同实验诊断方法来进行确诊的致命疾病。在本项研究中,样本从患狂犬病的狗的大脑中收集。采用三种实验论断方法：1）狗脑的压印涂片用直接荧光抗体技术（direct fluorescent antibody technique，DFAT）进行检查；2）细胞学检测的目的是鉴别内基氏小体（Negri bodies）；3）对福尔马林固定过的样品进行处理和研究，以确定组织病理学病变。在收集的10个样本中,有7个样本显示是狂犬病阳性。在上述实验诊断技术的比较中,dFAT和细胞学检测具有100%特异性,而组织病理学检测的特异性只有43.5%。

关键词: 狂犬病（Rabies）, 荧光抗体（fluorescent antibody）, 细胞学（Cytology）, 组织病理学（Histopathology）。 

前言

狂犬病是由高度嗜神经的单链RNA 丽沙病毒（lyssavirus）引起的最古老、最可怕的人畜共患疾病之一。与其他传染病相比，它可导致致命性脑脊髓炎，病死率最高。狂犬病在印度流行，约占全球狂犬病负担的36%。印度是人类狂犬病的温床，每年约有2万人死亡，占全球每年约5.9万人狂犬病死亡负担的三分之一。

流浪狗是动物感染的主要来源,在暴露或感染前和之后,疫苗接种是对抗该病的唯一有效方法,因为一旦症状出现,就没有任何治疗方法可以奏效。

材料与方法

标本在尸体检验期间采集，用于狂犬病的直接荧光抗体技术(dFAT)诊断，以及细胞学和组织病理学研究。对大脑进行了肉眼检查，观察其宏观变化。在海马大切面用吸墨纸吸去血后，取压片。根据WHO实验方案，使用多克隆抗体将载玻片在- 20֠C丙酮中固定处理后，进行直接荧光抗体技术(dFAT)检测。

压印涂片经绝对甲醇固定，采用经威廉（William）氏改良的范基森（Van Geison）染色法检测内基氏小体（Negri bodies）。收集包括大脑和小脑在内的脑组织用血毒素林（Hemotoxilin）和曙红（Eosin）染料进行组织病理学检测。

结果和讨论

在马德拉（Madras）兽医学院兽医病理学系进行的尸检中总共收集了11个狗大脑样本,其中一个样本作为阴性对照,来自进行常规尸检的动物。另外10个样本从针对狂犬病而进行尸检的动物中收集。这些动物基于临床体征被怀疑为患狂犬病,并曾置于狂犬病观察(Under Observation for Rabies，UOR)室直到其死亡。

在疑似狂犬病动物中确定有70%是狂犬病阳性,而按Mugale等的结论，在疑似病例中狂犬病的总体发病率为52%。剩下的动物可能是因其他原因而死亡。在70%(7 / 10)的病例中,未发现大脑有任何变化(见图1)。但在30%(3/10)的病例中,因脑膜充血而使整个大脑的脑膜变成红色(见图2)。

图1:   正常大脑（患病动物的脑也可能无变化）

图2: 脑出血和充血（部分患病动物的脑可能发生明显变化）

压印涂片的细胞学检查的采用经威廉（William）氏改良的范基森（Van Geison）染色法检测，10个疑似狂犬病样本,7个样品被识别为狂犬病阳性，因发现其中存在胞浆内包涵体,即神经细胞内的内基氏小体（Negri bodies）(见图3)。采用经威廉（William）氏改良的范基森（Van Geison）染色法染色，可发现存在于神经元细胞中的洋红色胞浆内包涵体，即内基氏小体（Negri bodies）。

图3:   内基氏小体（Negri bodies）的细胞学检测。

样本检测采用直接荧光抗体技术(dFAT)。在10个样本中,有7个样本在荧光显微镜下的荧光表明狂犬病毒(RABV)抗原存在于受影响的细胞中(见图4)。在阳性样本中,观察到苹果绿色荧光在荧光显微镜下聚焦于特定波长。

图4:    对海马体的压印涂片用dFAT检测,交联的抗狂犬病抗体呈现苹果绿色荧光。

在组织病理学检查中,11个样本除了从正常动物收集的1个阳性对照样本外,在狂犬病感染的动物中注意到各种变化,例如在100%(7/7)的阳性病例中观察到充血和轻度的海绵病(图5)。在43.5%(3/7)的病例中可见到内基氏小体（Negri bodies）。在43.5%(3/7)的阳性病例中,记录到染色质分解（ Chromatolysis）、卫星现象（Satellitosis）、围管现象（Perivascular cuffing ）和神经元变性（neuronal degeneration）。各种组织病理学的改变,如普肯耶（Purkinje）细胞变性,星型胶质细胞增生（astrogliosis）也在14.3%(1/7)的病例中观察到。

图5:   大脑充血和轻度海绵层水肿现象（perivascular cuffing）

在组织病理学检查中，内基氏小体（Negri bodies）通常出现在狗的海马中，Wahan 等在60%的病例中观察到，而本文作者Tamizharasan等在大脑和小脑中观察到的概率为43.5%(3/7)。在诊断技术的比较研究中，dFAT是一种金标准技术，其细胞学的特异性为100%，而检查内基氏小体（Negri bodies）的组织病理学方法的敏感性仅为43.5%。

基于本项研究，可认定dFAT是金标准技术，细胞学方法可用作支持技术。组织病理学可用于鉴别诊断和各种病理改变的一般筛查。由于只有70%的疑似狂犬病病例呈阳性，因此应采用死前诊断技术来确认狂犬病，以便避免不必要的暴露后疫苗接种，并对有神经系统症状的动物进行除狂犬病以外的疾病筛查和相应治疗。

参考文献：

S Tamizharasan, et al,. Comparative study of DFAT, cytology and histopathology in diagnosis of rabies, The Pharma Innovation Journal， 2021; SP-10(11): 421-423,  https://www.thepharmajournal.com/archives/2021/vol10issue11S/PartG/S-10-10-264-489.pdf