大型学术专著《当代新疫苗》（第二版）于去年3月正式出版。

本人与中国食品药品检定研究院的李玉华研究员共同撰写了该书第40章《狂犬病疫苗》。

本博客将分若干次全文转载这一章的内容。今天转载的是本章的第6节：狂犬病疫苗制造(B)。

６ 狂犬病疫苗制造

本节目录：

（A）

6.1　狂犬病疫苗发展历程

6.2  狂犬病疫苗制造概要

6.3  疫苗生产用细胞

（B）

6.4  疫苗生产用毒株

6.5  疫苗生产及质量控制 

６.4 疫苗生产用毒株

目前，人用狂犬病疫苗都是灭活的，理论上讲，任何狂犬病病毒株都可以用来制备疫苗。实际上，现代人用狂犬病疫苗必须经过浓缩和纯化，如使用强毒株将对生产者构成严重生物安全问题（ＣＤＣ,1977）。此外，与减毒株相比，强毒株的病毒产量通常较低。

人用狂犬病疫苗生产用毒株应经过适应、减毒，具有稳定的生物学特性。毒株应具有包括毒株来源和后续的传代谱系资料等历史资料，并经国家药品管理部门批准。

对世界各地流行的狂犬病病毒街毒株和疫苗生产中所用的代表性疫苗株的基因组序列进行系统进化分析表明，目前所有上市疫苗所用毒株都属于基因１型狂犬病病毒。100多年来，世界各地流行的代表性狂犬病病毒街毒株尽管也有微小的差别或变异，目前用不同疫苗株生产的疫苗在中国和世界各地的效果未见明显差别。各国已批准使用的疫苗总体上来讲都能有效预防这些病毒的感染（孟胜利等，2009）。

６.４.１ 国外疫苗生产使用的三个主要毒株系列

国外使用的疫苗株全部可归类到巴斯德毒株（ＰＡＳ、ＰＭ、ＰＶ）、Flury ＬＥＰ和ＨＥＰ株、ＥＲＡ/ＳＡＤ株及它们的衍生株这三个系列中。 这些毒株都已完全适应在体内和体外培养。

ＰＡＳ株于1882年分离到，是最古老的狂犬病病毒疫苗株(Pasteur,1884)，用于制备神经组织疫苗（ＮＴＶ）。此病毒株仅在兔细胞传代300代。随后泛美人畜共患病中心出现著名的ＰＶ株，虽然没有文件记载的确切来源，但可能来源于ＰＡＳ株(Sacramento et al.,1992)。动物研究中使用的标准攻毒株ＣＶＳ来源于ＰＶ株。此外，普遍认为，ＰＭ株也来源于ＰＡＳ株。ＰＶ2061株，更准确地说为ＰＡＳ2061株，是ＰＶ株（或ＰＡＳ株）在兔脑传至2061代，已适应于Ｖｅｒｏ细胞、原代狗肾细胞、人二倍体细胞。ＰＡＳ株及其衍生株已经用于大量人用狂犬病疫苗制备，不包括原代地鼠肾细胞疫苗（ＰＨＫＣＶ）和纯化鸡胚细胞疫苗（ＰＣＥＣＶ）。然而，ＰＶ株（或ＰＡＳ株）及其衍生株的残余毒力仍然是一个严重的生物安全性问题。Fermi疫苗使用ＰＶ株，1960年在巴西的一次事故中直接导致至少18人死于狂犬病(Pará,1965)。

Flury株于1939年在美国佐治亚州分离到，在鸡胚细胞上传代减毒。ＬＥＰ病毒株和ＨＥＰ病毒株的开发原本是期望能代替ＮＴＶ,但使用全鸡胚开发出人用狂犬病疫苗的尝试最终失败。随后开发的纯化鸡胚细胞疫苗使用的ＬＥＰｃ25 病毒株是来源于兽用疫苗株ＬＥＰｃ23。

ＳＡＤ株于1935年在美国亚拉巴马州分离到。衍生株ＣＬ60和Vnukovo 32已经在加拿大和俄罗斯用于原代地鼠肾细胞疫苗的制备。许多ＳＡＤ株的减毒衍生株，如ＥＲＡ株、ＳＡＤ B19 株、ＳＡＧ1株和ＳＡＧ2株，已经广泛用在狂犬病减毒活疫苗中，用于野生动物的口服免疫，或狗和其他动物的注射免疫接种(Fehlner-Gardiner et al.,2008; Follmann et al.,1996)。

６.４.２ 国内疫苗生产使用的疫苗株

除了引进上述毒株外，国内使用有自主知识产权的毒株主要有2种（俞永新， 2009）。

ａＧ株于1931年分离自北京捕杀的犬脑，经兔脑连传50代，地鼠肾细胞传55代，后来又在豚鼠脑与单层细胞培养交替传代而得到。后又适应ＢＨＫ21细胞、地鼠肾细胞和Ｖｅｒｏ细胞，命名为北京株狂犬病固定毒。1980年以前，我国曾以此毒株作为羊脑疫苗的生产毒株。ａＧ株与国外使用的3个系列的疫苗株的亲缘关系相互都很接近，属于同一个系统进化分支。

ＣＴＮ1株于1956年分离自山东省死于狂犬病的患者脑组织。 经小白鼠脑内连续传56代后，经检定证实为狂犬病固定毒，又经人二倍体细胞ＫＭＢ17连续传50代以上。将ＣＴＮ1株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应，获得生产用的狂犬病病毒固定毒ＣＴＮ1株。1982年获原卫生部同意将此毒株扩大使用。1984年，ＷＨＯ狂犬病专家委员会第七次报告中，认可该毒株为狂犬病病毒固定毒株，列为可用于生产疫苗的病毒株。2005年，ＷＨＯ狂犬病专家委员会再次确认该毒株为符合要求的狂犬病疫苗生产用疫苗株。ＣＴＮ1株与前述4类疫苗株有一定区别，而与近30年来在中国流行的街毒株亲缘关系更接近，可归类为另一个分支（明平刚等，2006；Zhang et al.,2009)。

６.４.３ 疫苗生产用毒种的质量控制和检定

疫苗生产用毒种必须确保来源合理、清晰，代次明确。 应建立相应的种子库。

毒种的检定主要包括鉴别试验、病毒滴定、无菌检查、支原体检查、病毒外源因子检查、免疫原性检查等。

６.５ 疫苗生产及质量控制

除了细胞培养人用疫苗制备工艺和质量控制的通用要求（如无菌检查、外源因子检查、外观、装量、ｐＨ 、异常毒性检查、细菌内毒素含量、蛋白质含量检查、热稳定性试验、抗生素残留量检查、牛血清白蛋白残留量、稳定剂添加、游离甲醛含量、硫柳汞含量、冻干成品含水量检测等）之外，对人用狂犬病疫苗生产过程中重要的质量控制要求和检定方法说明如下（国家药典委员会，2015）。

６.５.１ 病毒纯化

灭活后的病毒液采用柱层析、蔗糖密度梯度离心等适宜的方法纯化，纯化后可加入适量人血白蛋白或其他适宜的稳定剂即为原液。

６.５.２ 病毒灭活

常用病毒灭活剂包括β-丙内酯（β-prppiolacton,β-ＰＬ）和甲醛。

β-丙内酯通过降解核酸来灭活病毒，而不直接作用于蛋白。β-丙内酯为含有四元环的烷化剂，分子式为Ｃ_３Ｈ_４Ｏ_２,能与包括核酸在内的许多亲和物质反应，主要通过核酸或蛋白酶的羟基，以及氨基酸等基团进行烷化反应，即这些基团的 Ｈ原子被烷基取代的反应，β-丙内酯对核酸的反应主要与嘌呤和嘧啶残基结构的修饰有关，特别是针对鸟嘌呤的1位和7位氮原子以及腺嘌呤的3位氮原子的修饰，如此被β-丙内酯修饰的鸟嘌呤被聚合酶错读成腺嘌呤，将导致ＤＮＡ链复制时由原来的Ｇ-Ｃ配对误译成Ａ-Ｔ，从而阻止新的活病毒复制。在高浓度β-丙内酯作用下，烷基化嘌呤诱导ＤＮＡ脱嘌呤，从而导致糖苷键断裂，破坏ＤＮＡ链的完整性。它还可以诱导ＤＮＡ链打开缺口，使ＤＮＡ和蛋白质之间以及双螺旋结构ＤＮＡ链之间发生交联而发挥病毒灭活作用。甲醛灭活原理是甲醛使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡，但不明显影响其免疫原性。用甲醛灭活时间长，一般需要在37～39℃处理24ｈ以上或更长时间，温度与灭活时间呈反比，并且灭活的效果易受温度、ｐＨ、甲醛浓度等因素影响。残留的游离甲醛若随疫苗注入机体，会产生刺激性反应。2015版《中国药典》三部规定，病毒收获液中按１:4000的比例加入β-丙内酯或者终浓度200μｇ/mL加入甲醛灭活。该方法应证明具有灭活病毒的能力，但不破坏其免疫原性。《欧洲药典》7.0规定，若使用β-丙内酯灭活病毒，浓度在任何情况下不得超过1:3500。ＷＨＯ规定，β-丙内酯浓度在1:(3500～5000)，2～8℃至少灭活24ｈ(ＥＤＱＭ,2010)。

６.５.３ 病毒灭活验证试验

灭活工艺结束时应立即取样进行病毒灭活验证试验。2015版《中国药典》三部规定，试验采用生产用毒株敏感的细胞中连续传代扩增三代，将样品混合后小鼠脑内接种，无动物死亡则判定灭活试验符合规定。如不能立即进行试验，试验用样品应保存在－60℃ 以下冻存，并应验证该条件不影响样品中可能残留病毒活力。

ＷＨＯ和《欧洲药典》7.0要求，接种相当于不少于25个人用剂量的灭活病毒悬液至与疫苗生产相同类型的细胞培养物。每7天传代一次，总共培养21天后，再用免疫荧光试验检测细胞培养物中的狂犬病毒。若未检测到狂犬病毒，则病毒灭活符合要求。与动物试验相比，细胞培养法缩短了检测时间且不存在免疫系统的干扰，根据细胞内荧光灶的有无即可直接证明样品中是否存在活病毒，避免了小鼠间个体差异的影响，使检测结果具有更好的灵敏度和重复性（ＥＤＱＭ,2010)。

６.５.４ 疫苗效价测定

目前，ＷＨＯ认可的测定人用狂犬病疫苗的金标准方法为ＮＩＨ小鼠法。中国的人用狂犬病疫苗效价的国家标准分为放行标准和效期内标准：放行标准为每剂不低于4.0 IU，效期内标准为每剂不低于2.5 IU。如企业标准高于国家标准则应按企业标准执行。

小鼠攻击试验有许多缺点：不仅昂贵、耗时，而且须使用大量小鼠，违背了动物保护原则；且因小鼠很难避免个体差异，导致结果不稳定。最近，《欧洲药典》已批准使用一种血清学效力检测法(serological potency assay,ＳＰＡ)  作为上述攻击试验的替代检测。ＳＰＡ是基于使用改进的快速荧光灶抑制试验（ ｍＲＦＦＩＴ）来测定接种小鼠体内的狂犬病中和抗体滴度。目前，该方法能够测定的疫苗效价的下限是每剂1IU(Servat et al.,2015)。 

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