狂犬病的确诊：如何在病人尚存活时进行实验检测？（更新版）

    狂犬病必死！不死不是狂犬病！死亡是狂犬病最后确诊的必要条件之一。

WHO的相关文件明确认定：只有实验室检测才能确诊狂犬病。而狂犬病实验室诊断的金标准是在死后尸检时，通过荧光抗体试验（FAT）检测到脑组织中存在狂犬病毒抗原。

要在病人尚存活时确诊狂犬病是比较困难的，特别是在无明显的疯动物咬伤史，且临床症状不典型的情况下。

但现在已有越来越多的实验证据显示，活体样本中的唾液、脑脊液和血清（血液）的实验室检测很有价值，有助于使更多临床诊断的病例得到确诊。临床诊断为狂犬病的病人在发病后期的血清、脑脊液和唾液样本的实验室检测阳性率分别可达11%、21%和32%（尿液的阳性率为0%，没有诊断价值）。对这一部分病人在尚存活时就能确诊狂犬病。但检测为阴性的病人并不能排除狂犬病。

近日网上有个热点：《杭州姐弟先后被狗咬：姐姐患狂犬病致脑死亡，弟弟及时打疫苗》。姐姐脑死亡的病因到底是不是狂犬病？引起了激烈的争议。本人曾在题名为《关于杭州女孩狂犬病脑死亡疑似病例的讨论》的博文（http://blog.sciencenet.cn/blog-347754-1262672.html）中提出：“整个事件其实可能根本与狂犬病无关”！在发病一个多月后，目前此女孩仍在ICU病房中用包括呼吸机在内的多项措施抢救。

对于该女孩的狂犬病诊断，以下研究论文有较大参考价值。

中国的人狂犬病：基于证据对改进病例检测和资料收集的新建议（Human rabies in China: evidence-based suggestions for improved case detection and data gathering）

该文于今年6月1日在线发表在专业杂志《Infectious Diseases of Poverty（贫困所致传染病）》 上，作者为中国CDC等单位的李浩（Hao Li）等。

以下介绍该论文的主要内容。 

背景:

尽管目前中国报告的人狂犬病的病例逐年减少，但中国的狂犬病仍然危害严重。多年来，实验室确诊的人类病例远远少于临床诊断的病例，这是一个需要解决的大问题。

2018年，WHO和其他国际机构共同发起了一项全球战略计划，到2030年消除狗介导的人类狂犬病。中国正积极参与这一计划，努力提高狂犬病监测和控制能力。

狂犬病由丽沙病毒引起，表现为急性进行性脑炎。脑炎的临床诊断是困难的。只有实验室检测才能确诊狂犬病。在中国，人狂犬病实验室确诊病例很少，是一个阻碍狂犬病根除的紧迫问题。

WHO狂犬病专家磋商会建议，应在人生存期间收集人体分泌物和体液，如唾液、脑脊液（CSF）、血清和一些组织，如皮肤活检样本，包括颈后毛囊来诊断狂犬病。脑组织是尸检的首选标本。然而，在中国，很难收集到脑标本，甚至皮肤活检样本也很难获得。

WHO建议使用脑脊液和血清样本检测狂犬病毒抗体。但中和抗体的检测，如快速荧光灶抑制试验(RFFIT)，因技术和设施条件要求较高，在中国各个地区性疾病预防和控制中心(CDC)开展起来比较困难。因此，在中国检测体液中的病毒RNA应该成为诊断人狂犬病最重要、最可行的方法。

对该病不同阶段的多种不同样本(如皮肤、唾液、尿液)进行分析已被证明可以提高检出率，建议在狂犬病的生前诊断中进行推广。

在本报告中，总结了中国CDC系统实验室在过去15年中对来自人类病例的数百份样本的分析，并比较了来自不同液体或组织的样本以及来自该病不同阶段样本的阳性率。根据所得结果，建议采用一个更有效的多样化的采样方案，以在中国和其他类似国家提高人狂犬病确诊病例的相对数量。

方法:

2005年至2019年，从中国CDC当地医院收集狂犬病临床疑似病例共164例的各类样本共271份。样本包括生前采集的唾液、脑脊液(CSF)、血清(血液)和尿液，以及尸检的脑组织、颈部皮肤组织和角膜。

除一份角膜样本外，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了包括唾液、脑脊液、血清和尿液在内的液体样本，以及大脑和皮肤组织样本是否存在病毒RNA。脑组织、颈部皮肤和角膜样本还采用荧光抗体试验(FAT)检测。角膜样本太硬，无法进行RNA分析，只能用FAT检测。

使用卡方检验比较不同液体或组织在疾病的不同阶段获得的阳性检测结果的数量，建议采用更有效的采样方案。

WHO目前不建议对血清标本进行病毒RNA检测，仅用于检测未接种疫苗患者的病毒中和抗体，但这些检测不是非常敏感。而且中和抗体的测试，如RFFIT，是非常专业的，很难在当地实验室普遍推广。

为此，作者提供了可行的采样方法，并修订了国家狂犬病监测计划。为当地CDC一线工作人员制定的新指南增加了对生存末期血清的收集和检测，这将改进我们对人狂犬病的监测和实验室诊断。

此项研究中超过2/3的病例只采集一种标本或一种组织，如果一个病例采集多份标本，且临床信息详细，将更好地支持最终的诊断结论。

结果:

总共164个临床疑似病例，共收集到样品271份。其中有114个病例是每个病例仅有1份样本，50个病例是每个病例有2份或2份以上样本。这165个临床诊断病例中共有65例得到了实验室确诊。 

表1　临床诊断狂犬病人不同类型样品的实验室检测结果

在确诊的65个病例中，41例只有一份可用样本，24例有两份或两份以上可用样本。

在死后的诊断中，所有23个病例的大脑样本都呈阳性。

对于生前样本，唾液样本阳性率最高(32%)，其次是脑脊液样本(约21%)。RT-PCR可以检测生命最后3天的血清或血液样本呈阳性。最值得注意的是，9/85(10%)血清(或血液)样本检测病毒RNA呈阳性。

其中两个病例的颈部皮肤组织可用，这些皮肤组织也被检测为阳性。

只有一个角膜样本是可用的，结果是阴性，尽管同一病人的大脑样本为阳性结果。

所有14份尿液样本均为阴性。　

采样时间的影响：很明显，唾液样本比脑脊液样本检测更早，也更容易。在症状出现后第2天收集的2个病例的唾液样本检测为阳性。只有两个脑脊液样本检测呈阳性，这两个病例的唾液样本也呈阳性。2个病例在唾液样本中显示间歇性排毒的典型特征。

血清样本检测到病毒RNA阳性：虽然WHO只建议收集血清作病毒抗体测试，本项研究发现10.6%(9/85)的血清样本使用RT-PCR检测结果为阳性。有7例只使用血清样本就可被确诊,另2例使用血清和唾液样本同时被确诊。在生命的最后几天,血清样本非常敏感,在死前0－3天检测的4个病例都是阳性。在1个病例中，在死亡前最后3天收集的每个血清样本检测病毒RNA都呈阳性。有4例患者的晚期血清样本呈阳性，而在病程早期采集的血清样本则呈阴性。

在40例生前检测阳性的病例中，有25例经尸检再次确诊。

因此，这些结果为疑似狂犬病病例的推荐取样程序提供了一些新的补充方法。

讨论

虽然病毒检测对疾病监测和控制至关重要，但目前报告的狂犬病临床疑似病例远远多于实验室确诊病例。在没有接触史或典型症状的情况下，仅凭临床表现诊断狂犬病可能很困难，而且往往不可靠，应使用实验室检测来确认诊断。

确诊狂犬病的金标准是用死后脑组织经FAT检测显示存在病毒抗原。然而，在死亡后获取脑组织仍然是一个挑战，在中国和许多其他国家都很少能常规进行。

尽管实验室技术有了重大发展，但对人狂犬病的生前诊断仍困难重重。虽然经确认的生前阳性检测结果可确诊狂犬病，但阴性结果则不一定能排除狂犬病的诊断，这是生前检测的一个主要限制。因此，建议对多个临床样本进行多项测试，并在可能的情况下尽量进行连续取样，以提高死前诊断的准确性和可靠性。

唾液和脑脊液中的核酸扩增技术，如RT-PCR，正越来越多地用于狂犬病的生前诊断。本项研究表明,唾液RT-PCR提供最早的和最敏感的阳性诊断测试。唾液样本典型的间歇排毒的特点也很明显体现在此项研究中,所以强烈建议收集每个病人每天连续3个或3个以上的唾液样本。

WHO和其他专家曾建议，将血清样本应用于生前诊断，但仅用于检测病毒抗体。重要的是，此项研究表明，在生命的最后3天收集的血清或血液样本也可以用来检测病毒RNA。这意味着，血清样本以及其他体液(如唾液和脑脊液)都可用于检测病毒RNA，以进行生前诊断。

此项研究中，几乎所有检测呈阳性的血清样本都是在生命的最后3天收集的。血清样本比脑脊液样本更容易获得，在生命临近结束的某些情况下甚至比唾液样本更容易获得。在疾病后期收集和分析血清，将大大提高生前实验诊断的准确性。

结论:

狂犬病患者生命最后3天的血清（或血液）样本也可检测到病毒RNA，即血清、唾液和脑脊液都可通过检测病毒RNA而用于狂犬病的生前诊断。

由于这项发现，已修改了我国狂犬病监测项目，增加了对生存期末期血清样本的收集和检测。这将改善我们对人狂犬病的国家监测和实验室诊断，提高人狂犬病病例的阳性率。

参考文献：

Li et al. Human rabies in China: evidence-based suggestions for improved case detection and data gathering，Infectious Diseases of Poverty，2020，9:60　（https://doi.org/10.1186/s40249-020-00672-9）　

相关博文：

狂犬病的临床诊断和确诊， 2013-7-30（http://blog.sciencenet.cn/blog-347754-712607.html）