狂犬病毒的分子流行病学（2）

——大型学术专著《狂犬病（Rabies）》最新版选译

第5章 分子流行病学（Molecular epidemiology）

作者：Susan A. Nadin-Davis

加拿大渥太华：加拿大食品检验署，渥太华Fallowfield实验室。

（Canadian Food Inspection Agency, Ottawa Laboratory- Fallowfield, Ottawa, ON, Canada）

5.3  病毒分型方法

流行病学调查依赖于区分具有共同起源的病毒和独立出现的病毒的能力，从而了解爆发的起源及其随后的传播。因此，病毒分型方法是这一过程的关键组成部分。历史上，这种变种(variants)的区分已经借助于抗原分型而得以实现，这依赖于一组单克隆抗体 (MAbs)的区分能力。该过程包括将每个单克隆抗体分别应用于狂犬病阳性脑材料的切片或涂片，并使用间接荧光抗体方法评估其与病毒靶点的结合。每个单克隆抗体的反应是阳性还是阴性，取决于它是否与特定的病毒抗原表位（epitope）结合，其性质取决于靶蛋白的一级氨基酸序列及其二级或三级结构。高分辨抗原分型测试板（panels）采用了多个单克隆抗体，针对与不同病毒变种相关的几个表位。

对于已经建立了健全的单克隆抗体测试板的实验室，这种病毒分型方法仍然是快速识别病毒变种的一种成本效益很高的工具。然而，有几个因素限制了这种方法更广泛的应用。在美洲，与不同蝙蝠种类相关的病毒变种的复杂性经常对采用美国CDC专门为拉丁美洲国家开发的分型工作构成挑战。制备出具有合适鉴别特性的更多的单克隆抗体可以克服这一问题，但需要制备和筛选大量能分泌MAbs 的杂交瘤，这一过程既费时又费钱。因此，最近进一步开发用于不同地理区域的抗原分型测试板的努力受到了限制。与此同时，由于核酸扩增和测序方法的进步，已被证明对病毒分离株之间的微小差异更敏感的遗传分型方法越来越受欢迎，这将是本综述的重点。

5.3.1  狂犬病毒的遗传特征

在1990年代早期,核酸扩增技术特别是逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)技术的发展，可生成病毒部分基因组的dsDNA副本并对其进行鉴定，为狂犬病毒的鉴定确立了一套全新的方法。随后将序列特异性探针或DNA插入染料纳入这些检测中，当扩增子（amplicon）产生时就会产生荧光信号，便于实时检测丽沙病毒，这种检测现在已越来越多地用于狂犬病诊断(见第12章)。虽然新的病毒测序方法不需要靶向扩增，但许多研究仍然使用这种方法，因为它相对容易和成本可控。

选择丽沙病毒的基因或靶向区域进行鉴定往往取决于研究的目的。如果在不同的储存宿主中传播的病毒的鉴别是主要目标，那么对病毒任何基因中相对短的区域进行鉴定就足够了。当研究更侧重于更好地理解特定变种的传播时，针对保守度较低的基因组区域，如P基因或G-L基因间区域可能更有用。最终，对完整病毒基因组的鉴定将获得最大可能的结果，支持这种详细分析的技术将在后面进一步讨论。

一旦使用RT-PCR生成一个扩增子（amplicon），可以使用几种不同的技术对其进行鉴定。在过去，这类鉴定方法包括限制性片段长度多态性分析、异质双链迁移率测定，以及使用靶向特异性试剂通过RT-PCR选择性放大特定病毒变种。另一种病毒分型方法采用基于P基因序列的变种特异性探针对福尔马林固定脑组织进行原位杂交，以区别许多加拿大变种。更近期的方法包括焦磷酸测序技术：对基因组的一个非常短的片段进行测序，以及基于扩增的检测：在逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP) 或实时RT-PCR 检测中使用变种特异性试剂。

这些方法中有一部分是适用于当时的现成的技术，而利用荧光染料和毛细管电泳的高效桑格测序方法的发展，使PCR产物的直接核苷酸测序变得容易实现。因此，在过去35年里，产生了大量的丽沙病毒序列数据，其中大部分可在NCBI和EMBL等公开数据库中获得，从而为病毒比较提供了全面的参考资料来源。

参考文献：

唐青 严家新：第六章 狂犬病病毒的分子流行病学和系统进化史，《狂犬病和狂犬病疫苗》(俞永新主编，中国医药科技出版社，2009年版)

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