广谱狂犬病毒疫苗研究的最新进展（1）

目前丽沙病毒属的病毒，即狂犬病毒和狂犬病毒相关病毒，总共发现有大约18种，可细分为三个遗传谱系（phylogroups）。现有狂犬病毒疫苗是用经典的狂犬病毒（RABV）制备的，只能针对遗传谱系１的病毒提供较好的免疫保护作用，而对遗传谱系２和３的病毒则效果可能不佳。为了确保人类完全免除所有类型狂犬病毒的危害，有必要开发广谱狂犬病疫苗，能针对各种类型的狂犬病毒都发挥免疫保护作用。由于基因１型狂犬病毒（RABV）以外的17种丽沙病毒绝大多数都以蝙蝠为宿主，目前已知它们对人的危害很罕见，所以长期以来对此类疫苗研发的需求和动力不足，因而经费来源有限，进展缓慢。

近期美国费城杰弗逊大学和美国ＣＤＣ的研究人员合作在广谱狂犬病毒疫苗研究方面取得重要进展，他们的研究论文于7月21日在线发表在《Cell Reports （细胞报告）》杂志上。现将该论文的主要内容进行摘译（因内容较多，分数次发布）。

含嵌合糖蛋白的丽沙病毒疫苗具有跨遗传谱系的保护作用

(Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups)

简介

狂犬病相关病毒会引起与狂犬病毒类似的疾病，但目前的疫苗并不总是能起到保护作用。Fisher等人设计了一种具有功能的嵌合包膜蛋白的疫苗，该蛋白结合了两种高度分化的病毒的部分组成成分。这种疫苗能在小鼠体内产生强大的免疫反应，保护小鼠免受疾病的侵袭。

图解摘要(Graphical Abstract)

本论文的亮点（Highlights）

 　结构模型用于设计一种嵌合病毒糖蛋白。

 嵌合蛋白具有功能并能促进病毒复制。

 狂犬病相关病毒疫苗诱发保护性中和抗体。

 佐剂提高抗体反应的强度和通用性。

摘要(SUMMARY)　

如果不进行处治，狂犬病几乎100%是致命的，每年估计有59,000人死亡。适当接种疫苗和生物制剂非常有效。16种与狂犬病相关的病毒(丽沙病毒)同样都是致命的，但有些病毒的歧异程度足以逃避目前基于经典狂犬病毒(RABV)制备的疫苗和生物制剂的保护作用。

我们现在报告疫苗LyssaVax的开发和鉴定。这种疫苗的特点是其结构设计：具有功能的嵌合糖蛋白(G)含有RABV的 G蛋白和高度异化的Mokola病毒(MOKV) 的G蛋白在免疫学上重要的区段（domains）。LyssaVax在小鼠中可诱导产生同时针对RABV和MOKV的G蛋白的高滴度特异性抗体。免疫血清还可以中和一系列跨越主要遗传谱系的野生型丽沙病毒。经LyssaVax免疫的小鼠在用RABV和MOKV的重组病毒攻击时能得到保护。总之，LyssaVax证明了Ｇ蛋白结构建模在疫苗设计中的作用，并已构建成了一种广谱的丽沙病毒候选疫苗。

引言（INTRODUCTION）

在卫生基础设施薄弱的发展中国家的研究表明，人类狂犬病死亡人数可能被严重低估。如果在出现症状之前不采取干预措施，狂犬病毒(RABV)引起的脑炎是人类已知的最致命的病毒感染。较少为人所知的是，与狂犬病相关的丽沙病毒引起相同的人畜共患疾病，与RABV具有相似的死亡率，但研究却少得多。丽沙病毒属由17种单链负链RNA病毒组成，至少分为三个遗传谱系(RABV被归为遗传谱系I)。经典的RABV在除南极洲以外的所有大陆上传播;非RABV丽沙病毒在欧洲、非洲、亚洲和澳大利亚流行。

如果及时注射疫苗和抗血清，狂犬病的存活率很高。RABV疫苗被赞誉为是疫苗可预防传染病中成本最低但效益最大的疫苗之一(与Gavi，即全球疫苗和免疫联盟和各国政府关于避免每例死亡的代价相比)。至关重要的是,其他狂犬病相关病毒引发的疾病并不总是能用以RABV为基础的疫苗和生物制剂进行预防:针对遗传谱系 II和III病毒只能提供非常有限的保护，即使在遗传谱系Ｉ之内的病毒感染也存在暴露后预防(PEP)的失败，尽管在系统发生上是与RABV的关系较近的病毒。尽管如此，现有的疫苗都是单一地针对RABV开发的。目前对丽沙病毒的研究特别是对广谱丽沙病毒疫苗的开发缺少应有的投资，如果出现一种遗传差异较大的丽沙病毒，将会产生深远的影响。

非RABV丽沙病毒分担的疾病负担比例尚不清楚:由丽沙病毒引起的病毒性脑炎和相应症状与RABV感染难以区分，目前基于高度保守的核蛋白(N)的诊断试剂无法区分丽沙病毒。在人类病例或动物群体监测中，只有在很少情况下才有鉴别性诊断方法可用。非RABV丽沙病毒感染的确切证据只能在死后分析中得到，而且可用的方法(病毒基因组测序或用不同丽沙病毒的特异性抗体探测)还没有标准化。在野生动物中的血清阳性率研究表明，与RABV相比，丽沙病毒以较低但稳定的比例传播。由6种非RABV丽沙病毒引起的少量人类死亡已经被证实，但实际数字可能更高。

散发性RABV暴发和新丽沙病毒的同步发现挑战了我们对丽沙病毒进化和宿主切换的理解。RABV可能起源于蝙蝠病毒，然后多次传播到陆地哺乳动物宿主，特别是狗。目前95%的人类RABV死亡是由犬类造成的。丽沙病毒在蝙蝠中传播，但有两个显著的例外：Ikoma病毒(IKOV)和Mokola病毒(MOKV)的储存宿主尚未得到鉴定。它们进一步适应陆地环境的可能性以及随之而来的人类风险增加值得关注。遗传谱系２的歧异的成员MOKV是非RABV丽沙病毒中首批被发现的病毒之一,以RABV为基础的疫苗在动物中不能针对该病毒提供保护已经被很好地记录下来:例如,MOKV已经多次从接种过狂犬病疫苗的家猫中分离出来。虽然观察到RABV和MOKV之间存在罕见的交叉反应，但目前的RABV疫苗不太可能提供针对MOKV的保护。

狂犬病的独特属性及其流行病学都要求在研制疫苗时考虑经济因素。尽管在成本与效用之间可作出有利的权衡，但目前的狂犬病疫苗价格昂贵，特别是对传播最频繁发生的发展中国家的农村人口而言。此外，现有疫苗长期以来的安全性和可靠性为新疫苗的研制设置了很高的门槛。因此，在研制具有更广谱保护的疫苗时，我们的目标是在组成和配方方面与目前的疫苗相似:含单一毒株的灭活病毒粒子。糖蛋白(G)是丽沙病毒粒子表面的唯一蛋白，血清中针对G的病毒中和抗体(VNAs)被认为是预防狂犬病的主要相关蛋白。因此，我们建议的疫苗设计的重点是G蛋白的遗传工程操作。

创建嵌合蛋白抗原是一种成熟的技术，可用于调节免疫反应。构建基于表位（epitope）的疫苗是一种具有吸引力的方法，可以提高疫苗的安全性、效力和通用性。其他研究小组之前曾试图创建RABV G和MOKV G的嵌合G蛋白，无论是交换抗原位点还是整个区段（domains），都未获得明确结果或未能成功。位点转换必须基于已知RABV Ｇ的抗原位点。我们在RABV G上凭经验确定了VNA（病毒中和抗体）结合的五个抗原区域，这使我们能够深入了解中和反应的机制和针对RABV的体液反应。但是，对于其他的丽沙病毒的G蛋白还没有进行详细的研究，所以这些短区域的交换可能会错过其他重要的位点。这从最近 RABV和拉各斯蝙蝠病毒(LBV)的Ｇ蛋白之间交换抗原位点的工作中可以明显看出:II位点被认为是RABV G上的一个主要位点，似乎在LBV G上也具有免疫优势，但其他位点的结果基本上是不确定的。交换整个域并不能可靠地产生感染性颗粒，可能是由于当时缺乏结构信息而导致的不完善的蛋白质工程。虽然嵌合体被运输到细胞表面并被纳入出芽病毒粒子中，但未能支持病毒复制，这与缺少重要的结构决定因素一致。

这里描述的疫苗是基于RABV疫苗株，其特点是含有经结构设计的嵌合丽沙病毒糖蛋白，包含分别来源于RABV的 G蛋白和高度歧异的MOKV的 G蛋白成分。在老鼠中，该灭活疫苗引发的抗体的滴度高、能中和多种丽沙病毒,能对抗RABV和重组MOKV的挑战。

（未完待续） 

参考文献：

Fisher et al., Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups, 2020, Cell Reports,  32, 107920　July 21, 2020 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107920