狂犬病毒中和抗体“最低”保护效价标准的确定

——大型学术专著《狂犬病（Rabies）》最新版选译

第13章　狂犬病免疫的检测（Measures of rabies immunity）

作者：Susan M. Moore, Chandra R. Gordon

美国堪萨斯州立大学兽医学院，狂犬病实验室/兽医诊断实验室

13.5　确定对狂犬病疫苗的“适当”或“最低”反应

（Defining “adequate” or “minimum” response to rabies vaccination）

众所周知，接种疫苗产生的狂犬病毒中和抗体(RVNA)可使与患狂犬病动物接触的人避免患狂犬病。对狂犬病暴露风险较高的人进行暴露前接种，可对未被注意到的暴露提供保护，并在已知暴露时减少接种针次，提高保护效率。对这类人群应定期检查RVNA滴度，以评估是否需要加强接种疫苗。关于评估狂犬病疫苗接种的抗体反应的标准有两个主要来源:WHO狂犬病专家委员会和免疫实践咨询委员会( Advisory Committee on Immunization Practices ，ACIP)。由于这两种来源的标准给出的可接受水平目前有所不同，而且缺乏对这些水平如何获得及其含义的了解，因此在医疗和兽医领域对于如何解释狂犬病血清学结果以作出关于是否需要进行加强接种的决定方面存在混乱。狂犬病是一种致命疾病，预防狂犬病的相关标准应当非常明晰和准确。最近完成暴露后系列接种的患者的最佳保护水平可能与2年前接受过暴露前接种的个体由于采血时间的原因而显示持续免疫的水平不同(Van Nieuwenhove, Damanet， &　Soentjens, 2019)。卫生专业人员在作出有关预防狂犬病治疗的挽救生命的决定时，无论是暴露前还是暴露后，都需要参考明确的指导方针。越来越多的宠物主人和兽医反对对宠物进行加强疫苗接种，并将狂犬病血清学结果作为血清阳转的证据，作为对抗要求加强接种的法规的理由。随着这种情况的发展，监管官员需要全面了解这些中和抗体保护数据和可以使用的检测方法。此外，疫苗和狂犬病免疫球蛋白产品的审批要求包括狂犬病血清学数据，研究资料应设置RVNA能达到的可接受水平。各种指南、建议、法律和法规应明确规定适用于推荐的实验室方法的可接受RVNA水平，并明确可能适用不同水平的情况。

由于狂犬病可通过接种疫苗产生RVNA来预防(其他免疫介质也可能起作用，但不容易测量)，因此在测试人体疫苗的抗体反应时，最好使用定量RVNA的方法。目前，最常用的方法是RFFIT（快速荧光灶抑制试验）和改进的RFFIT方法。为此目的而采用的方法不仅应确认适用于定量测定RVNA，还应标准化，以便与其他实验室和已建立的人类疫苗接种指南和疫苗制造商的说明进行比较。该方法应当能提供与标准和/或规定有关的检测结果，采用指定的计量单位并能达到所要求的检测水平。不存在特定的RVNA水平，能代表在所有情况下在所有宿主中对所有狂犬病毒变种感染都具有绝对保护。

关于疫苗接种可提供针对狂犬病的保护的证据，以及用狂犬病血清学结果预测保护能力的数据，主要来自已发表的动物狂犬病攻毒（challenge）研究。Aubert (1992)的一篇综述是关于狗和猫的攻毒研究，包括检测狂犬病疫苗抗体反应的血清学数据。结论是确保具有保护作用所定义的狂犬病血清学指标，是RVNA滴度超过特定的截止（cut-off）值，狗和猫的截止值分别为0.2和0.1 IU/mL（国际单位/毫升）。此前Bunn和Ridpath(1984)的一份报告支持了Aubert的结论，该报告介绍了在一项攻毒研究中，将存活率与动物血清学结果进行统计分析后所获得的生存概率。RVNA水平在0.5 IU/mL时，生存概率约为99%，RVNA增加到约1.0 IU/mL时，生存概率会随之增加。

关于基于狂犬病血清学的免疫反应持续时间和生存率预测的数据发表得很少。 Lawson and Crawley (1972)的研究提供了较多的信息。研究人员分别在接种疫苗5年和4年后对接种疫苗的狗和猫进行了攻毒试验，结果发现92%的狗和100%的猫存活了下来；54%的狗和87%的猫在攻毒前检测到RVNA。此外，在一份调查已发表的关于根据狂犬病血清学预测野生动物生存能力的报告中，由于研究设计和使用的试验方法/临界值高度可变，几乎无法得出结论(Moore et al.，2017)。此外，在这篇文章中，研究存活率与标准化的狂犬病血清学结果之间的关系，RFFIT和阻断（blocking）ELISA之间确定了一个合理的密切联系;然而，也发现在物种间存在差异。

大多数受试者在人类疫苗临床试验中所达到的RVNA水平，是确定接种疫苗的人具有足够的免疫反应的最低抗体水平的主要依据。WHO推荐的水平和目前ACIP推荐的是不同的。这种差异并不是最近才有的，但对这种不同水平的误解很常见，甚至在已出版的文献中也确实存在。ACIP推荐使用RFFIT，因为其他的方法(如ELISA, IFA，免疫层析法)不能特异性地测量RVNA，因此不能与RFFIT相关联。由于采用WHO标准将导致更多已接种疫苗的人被归类于“需要加强”组，而且ELISA方法可能产生与指南中规定的水平不相关的结果，因此需要明确用于决定是否接种的这些要素。巴斯德于1885年生产出的疫苗被用于进行针对狂犬病的免疫接种，此类疫苗在出现组织培养疫苗之前基本上没有变化，涉及多次接种，也可能产生严重后果(Steele, 1975)。相比之下，现代的组织培养疫苗是安全有效的 (Wunner & Briggs, 2010)。由于疫苗的安全性以及对RVNA对狂犬病暴露的保护作用的了解，人们采取了对经常或持续有暴露风险的人进行暴露前接种的做法(ＣＤＣ，2008年)。最初，建议这一人群每两年接受一次疫苗加强接种，以确保RVNA的持续保护(ＣＤＣ，1976年)。RVNA在狂犬病疫苗研制初期是通过MNT（小鼠中和试验）测定的，MNT是一种繁琐的小鼠体内试验。由于担心过于频繁的疫苗接种的副作用，同时由于对RVNA的检测采用了快速RFFIT方法，建议从定期加强疫苗接种改为只有当RVNA水平低于足以应对风险的水平时才进行疫苗加强接种(CDC，1980)。

1977年11月在西德马尔堡（Marburg）举行的WHO/IABS（国际生物科学联盟）关于组织培养生产的人用狂犬病疫苗标准化联合专题讨论会上推荐的抗体水平为0.5 IU/mL (Bogel, 1978)。在提交了国际人类狂犬病疫苗试验的几次结果后，专项工作组提出了建议。该专项工作组的任务是确定采用缩减的免疫接种方案和进行暴露前疫苗接种时对疫苗效价的要求。该专项工作组声明:该工作组建议在最后一次接种后4周时对血清进行测试，在此期间达到最低0.5 IU/mL值就可证明发生了血清阳转(Bogel, 1978)。根据随后关于暴露前或暴露后接种系列疫苗后狂犬病毒抗体水平的报告，0.5 IU/mL的抗体水平被接受作为血清阳转的证据。ACIP指定的水平也是基于人类疫苗试验的RFFIT结果，以及在1:5以上的血清稀释中未发现非特异性抑制(假阳性)反应(个人通信, Jean Smith)。由此得出的结论是，如果在这个水平上检测到特定的RVNA滴度结果，那么血清阳转已经实现。ACIP最初公布的用RFFIT方法检测的推荐的抗体水平是近似于0.1 IU/mL (Moore &　Hanlon, 2010)。因此，0.5和0.1 IU/mL两个水平虽然相差5倍，但都是基于相同的原理，即RVNA的特异性检测。不同之处在于，在多大程度上可以确认所指定的抗体水平确实是真实的检测，而不是假阳性。WHO没有定义所使用的检测方法，并承认检测方法和实验室能力之间存在差距。关于方法的早期出版物描述了狂犬病血清学结果经常出现不一致;通过MNT和RFFIT以及不同的实验室所获得的RVNA结果差异很大 (Bogel, 1978; Fitzgerald, Gallagher, Hunter, Spivey, & Seligmann Jr., 1978)。ACIP规定狂犬病血清学应采用RFFIT检测，因此只指定了一种单一的方法为被批准的方法。尽管ACIP定义了一种方法，但它没有定义RVNA的适当水平的标准。在进行改良的RFFIT测定的实验室中，血清稀释1:5时的完全中和可以代表不同的滴度和IU/mL值。除了使狂犬病血清学报告的结果数值标准化之外，还应定义包括可接受的RVNA测定方法的具体参数和标准试剂，以便于解释结果，并据以确定是否需要进行加强接种。

理解所用方法并能对结果进行解释对于人类和动物的最佳管理至关重要(Moore et al.， 2017)。间接ELISA方法检测和量度狂犬病毒特异性抗体的存在是基于其结合能力;它们量度的不是抗体的中和能力 (Irie & Kawai, 2002)。对狂犬病疫苗的免疫反应包括多克隆抗体的产生。在每个个体中，多克隆抗体可能包括在亲和力、活动性和中和狂犬病毒能力上不同的多种克隆抗体。因此，结合抗体和中和抗体水平之间的关系不是线性的，无法预测。在一个个体中，ELISA结果可能高于RFFIT结果，而在另一个个体中，情况可能相反(Moore et al.， 2016)。如WHO和ACIP所述，将“适当”水平的病毒中和抗体应用于ELISA结果并不会对每个人都准确。方法的有效性对每个实验室都是独特的，对验证的参数应该仔细考虑。方法验证文件须有执行标准，并包括下限定量(LOQ)的确定和验证。这是能产生精确结果的最低要求。根据上文所述的历史，WHO和ACIP都认为下限定量(LOQ)是对狂犬病疫苗接种的适当抗体反应。每一个实验室采用的方法都会产生一套狂犬病血清学结果，在对有暴露风险或已发生暴露后的人或动物进行临床管理时，需要考虑适当的狂犬病疫苗抗体反应的两种不同标准背后的基本原理，这样才能使相关指南的语言更加明晰。在综合人类狂犬病疫苗临床试验的三项研究的一篇综述中，当阴性结果的截止（cut-off）值设定在0.1 IU/mL时,未进行狂犬病疫苗接种的受试者非特异性/可交叉反应的百分比范围是1.3%到4.3%，但当截止值设定在0.4 IU/mL时，这个比例降低到0%到0.4%。这些发现支持将0.5 IU/mL认定为在动物研究中达到稳健的保护水平的标志，采用此截止值同时能降低发生非特异性反应的概率。

与最初发表的研究相比，不同人群中疫苗接种后最低抗体效价低于WHO或ACIP指导方针的人数所占比例没有变化。堪萨斯州州立大学狂犬病实验室对2005年至2011年三所兽医学院各班级学生的狂犬病血清学结果进行了回顾，证明了在这7年期间狂犬病血清学检测与狂犬病疫苗反应的一致性(Moore, 2015)。未能达到ACIP水平的人口百分比为0%至8%，未能达到WHO水平的人口百分比为15%至25%。这些比例类似于已发表在同行评议文献中所报告的：在暴露前接种疫苗的个人的临床疫苗研究中，2% - 7%的接种过疫苗的人在２年后在血清作1:5稀释后未能显示完全的中和作用，而大约75%的人在暴露前接种疫苗后的5－10年仍然是血清阳转的 (>0.5 IU/mL) (Mansfield et al., 2016; Rodrigues et al., 1987; Strady et al., 1998)。

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权威的大型学术专著《狂犬病（Rabies）》最新版已面世 2020-06-29