通过检查粪便来估计丽沙病毒在蝙蝠群体中的流行

 在今年12月8日出版的专业杂志《人畜共患病与公共卫生（Zoonoses Public Health）》上，荷兰鹿特丹伊拉斯谟（Erasmus）大学医学中心病毒学系的Thijs Kuiken等发表了一篇研究论文：Faeces as a novel material to estimate lyssavirus prevalence in bat populations.                                                                                                                   现将这篇论文的主要内容介绍如下：

摘要

狂犬病是由丽沙病毒感染引起的。蝙蝠狂犬病关系到公共卫生和蝙蝠保护。目前研究蝙蝠群体中丽沙病毒流行的方法是采用口腔拭子，这种方法对蝙蝠有侵袭性，对操作者有危险，耗时且昂贵。在许多情况下，这样的取样是不可行的，因此，目前我们对蝙蝠狂犬病流行病学的了解是有限的。

粪便通常容易从蝙蝠群落中收集而不干扰蝙蝠，因此可以作为研究丽沙病毒流行的实用和可行的材料。为了进一步探索这个想法的可行性，我们对7只大棕蝠（serotine bats ，Eptesicus serotinus) 的粪便样品和口腔拭子进行了病毒学分析，这些大棕蝠的大脑样品对欧洲蝙蝠1型丽沙病毒(European bat lyssavirus ,EBLV‐1)呈阳性。我们还对这些蝙蝠的消化道样本进行了免疫组织化学( immunohistochemistry,IHC)和病毒学分析，以确定粪便中丽沙病毒的潜在来源。

我们发现，7只蝙蝠的粪便样品用RT‐qPCR 方法检测狂犬病毒的RNA，结果有6份呈阳性，占86%，而这7只蝙蝠的口腔拭子均呈阳性，为100%，即这两种样品对丽沙病毒检测的敏感性几乎相同。粪便中的丽沙病毒RNA可能来源于从唾液腺或舌头分泌入口腔的病毒，这些病毒与唾液一起被吞食。6只蝙蝠的唾液腺用免疫组化及RT qPCR检测，结果有5只蝙蝠呈阳性。4只蝙蝠的舌头用免疫组化方法检测，有3只呈阳性。病毒无法从7个粪便样品中分离出来，这表明在粪便中检测到的丽沙病毒RNA没有传染性，因为狂犬病毒经过消化系统的消化作用，病毒完整颗粒被降解，只剩下RNA片段，无感染性。在大多数受感染蝙蝠粪便样品中可检测到丽沙病毒的RNA，这表明蝙蝠的粪便样品可进一步用于蝙蝠丽沙病毒的流行病学研究。

（补注：蝙蝠的粪便干燥后是一味较常用的中药，名为夜明砂，中医认为是清热明目、散血消积的良药，治疗大多数眼科疾病都会用到。）

本项研究的意义

人类暴露于患狂犬病的蝙蝠可能传染狂犬病。这使得蝙蝠狂犬病成为公共卫生和蝙蝠保护的问题。蝙蝠狂犬病的流行病学知识有限，阻碍了预防措施的实施。因此，我们应该改进我们的策略，以调查自由生活的蝙蝠的狂犬病流行率。我们在7只确诊的患狂犬病的蝙蝠中6只的粪便样品中发现了丽沙病毒RNA，这表明粪便检测可作为蝙蝠丽沙病毒流行病学研究的一种新方法而进一步探索。 

狂犬病是一种由丽沙病毒感染引起的致命神经系统疾病。人们通常通过受感染的食肉动物或蝙蝠叮咬而感染。所有物种，包括蝙蝠，都有相似的发病机制。通常，病毒通过受感染宿主的叮咬进入新宿主，并感染叮咬部位的神经。一旦进入神经系统，病毒就会逐渐传播到大脑，然后从那里到达唾液腺和舌头的神经。病毒一旦进入这些器官，就会被排泄到口腔，然后从那里传播到下一个宿主。

丽沙病毒在全球范围内在蝙蝠中传播，新的丽沙病毒种类还在不断被发现。某个蝙蝠种群当前是否存在丽沙病毒感染？进行病毒流行率估计和检测对于减轻公共卫生风险以及保护蝙蝠都是必要的。通常使用两种方法。一种是从一个种群中捕获蝙蝠，用口腔拭子检测它们是否携带病毒。这需要获得管理部门的许可，需要训练有素和接种过疫苗的人员，这既不切实际，又具有侵入性。另一种方法是测试患病或死亡蝙蝠的大脑，这部分蝙蝠不能代表整个蝙蝠种群。在蝙蝠群体中检测丽沙病毒特异性抗体是了解丽沙病毒流行病学的另一种策略，但不能区分当前和过去的感染或接触，即不能提供任何有关当前病毒流行的信息。因此，需要一种替代方法。

粪便样本已被证明可以有效地确定蝙蝠种群中其他病毒感染的患病率。但到目前为止，粪便还没有用作研究丽沙病毒流行的材料。这可能是违反直觉的，因为丽沙病毒的攻击目标是神经系统，而不是消化系统。尽管如此，曾有一项研究表明，在受感染蝙蝠的粪便中可以检测到狂犬病毒RNA(40%阳性)。因此，我们进行了一项试点研究，以评估粪便作为研究丽沙病毒流行的材料。

这项初步研究的结论是，粪便是在蝙蝠死亡前后检测欧洲蝙蝠1型丽沙病毒(EBLV 1)的合适材料。粪便中丽沙病毒的可能来源是唾液腺、舌头或两者，病毒从唾液腺排泄到口腔，然后与唾液一起被吞咽。这是基于我们的知识，这些器官是丽沙病毒在蝙蝠体内排泄的来源，并得到本研究中唾液腺和舌头样本的RT qPCR和免疫组化 (immunohistochemistry ,IHC)检测结果的支持。

粪便是否可用于研究自由生活的蝙蝠中丽沙病毒的流行情况仍有待确定。为此，需要在受感染蝙蝠的粪便中检测到丽沙病毒，不仅是在死亡前后，而且在蝙蝠明显健康的临床前阶段也是如此。实验感染的结果提供了蝙蝠发病前丽沙病毒就开始排出的证据。不同种类的蝙蝠接种各种狂犬病毒，感染的动物通过唾液排出丽沙病毒,这就是在我们的粪便样本RNA的可能来源,在蝙蝠死亡前几天到几周发生,也发生在显示临床症状之前。因此,我们也推测在自由生活的感染了丽沙病毒的蝙蝠的粪便中，在蝙蝠发病前就可检测到丽沙病毒 RNA。

我们的研究表明，应进一步研究如何将蝙蝠的粪便用于研究丽沙病毒在蝙蝠中感染流行的情况。应该考虑到，在非流行期，在储存宿主群体中的患病率预计将很低(0.7% - 3%)。例如，如果一个包括200只蝙蝠的群体的预期患病率为2%，则需要至少105个样本才能说明是否存在丽沙病毒感染(95%置信区间，p < .05)。对于1000只或更多蝙蝠构成的群体，需要的样本量是148只。因为蝙蝠的粪便通常很容易收集，所以这些都是可行的样本数量。

我们认识到，在确定粪便样品是否可用于研究自由生活的蝙蝠群体中丽沙病毒流行情况之前，还需要进一步的验证。剩余问题还包括发病或死亡前多少天丽沙病毒RNA可在受感染的蝙蝠粪便中发现,在蝙蝠排便后多久丽沙病毒 RNA可以在其粪便中发现,以及如何确定采集的粪便样品的数量与同一个栖息地存在的蝙蝠数量的关系。然而，我们希望分享我们的想法和这些初步结果，以便其他研究人员有机会应用这种采样策略。丽沙病毒在蝙蝠群体内的循环对公共卫生和蝙蝠保护都是一个问题。我们希望藉由这项新的取样策略，能增进对蝙蝠狂犬病流行病学的了解。

原文全文下载：

Begeman L, Kooi EA, van Weezep E, et al. Faeces as a novel material to estimate lyssavirus prevalence in bat populations. Zoonoses Public Health.2019;00:1–5. 　https://doi.org/10.1111/zph.12672

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/zph.12672