原名：The Gut Microbiome Is Associated with Clinical Response to Anti–PD-1/PD-L1 Immunotherapyin Gastrointestinal Cancer 

译名：胃肠道肿瘤中肠道微生物与抗PD1/PD-L1免疫治疗的临床应答相关

期刊：Cancer Immunology Research

IF：8.728

研究受试者招募

该研究队列共纳入了19例结直肠癌患者，34例胃癌患者，14例食管癌患者和18例其他类型的胃肠道肿瘤患者(表1，N=85)。队列中受试者主要为男性，有一小部分人具有既往过敏史。在PD-1/PD-L1抗体治疗之前和治疗期间采集上述患者的155个粪便样本(图1)。11名胃癌患者在标准的PD-1/PD-L1抗体治疗的基础上接受化疗，被排除在后续分析之外。14名接受抗CTLA4治疗与抗PD-1/PD-L1治疗相结合的患者被纳入其中，根据RECIST （Response Evaluation Criteria inSolid Tumors）v1.1标准评价受试者的临床疗效，包括部分缓解(partial response, PR)、稳定期(stable disease, SD)和进展期(progressive disease, PD)。如果患者在治疗开始后达到持续至少3个月的客观反应(PR/SD)，我们将其定义为有反应者，或者无反应者(治疗开始后3个月内观察到PD)。在应答者和无应答者之间，在年龄、药物、性别、EBER状态、BMI、过敏史、MSI或先前的治疗方面没有发现显著的差异(表1)。

图1. 根据肿瘤类型划分的临床样本和样本采集时间。共采集85例胃肠肿瘤患者的155份粪便样本。实心黑点表示相对于PD-1/L1抗体治疗开始的样本采集时间；中空形状表示评估肿瘤进展的周期。在接受PD-1/PD-L1抗体治疗的同时接受化疗的患者被标记星号。

表1. 受试患者基本信息

2 PD-1抗体免疫治疗对胃肠道肿瘤患者肠道菌群的影响

该研究使用Silva数据库基于100 %序列相似性鉴定出了3852个OUTs，保留了319个OUTs用于后续的分析，在所有74名患者的319个OUTs中，有306个被确认。该研究在所有大肠癌、食管癌和胃癌患者的粪便样本中分别发现了308、317和314个OUTs。16S rRNA测序结果表明，治疗响应组中Prevotellaceae的相对丰度较高，而Bacteroidaceae的丰度则显著降低(图2A)。应答者和无应答者的Prevotella/Bacteroides比例有显著差异(图2B，Wilcoxon检验，P=0.032)。生存分析结果显示，与Prevotella丰度低的组相比， Prevotella丰度较高的患者在治疗开始后的12周内实现无进展生存(progression-free survival,PFS)的可能性更高(P=0.032，图2C，左)。相反，在这个队列中，Bacteroides的丰度与PFS呈显著负相关(P=0.014，图2C，右)。此外，该研究的关联分析表明，在该队列中，Akkermansia丰度较高的患者更加可能从PD-1/PD-L1抗体的治疗中受益。    虽然在多种疾病的相关研究报道中，肠道菌群较高的多样性与患者较好的临床反应有关，但本研究中发现，无论所选取的癌症类型如何，在队列中，应答者和无应答者之间肠道菌群的α多样性并没有显著差异(图2D，P=0.61)。在该研究中，由主要应答者组成的一个亚组则可以与其他患者显著地区分开(图2E)，进一步地，研究者发现上述差异主要是由Prevotella的丰度差异所驱动，与其他的临床特征无关。

图2 肠道微生物的分类组成与PD-1/PD-L1抗体治疗的临床响应相关。(A) 根据16S rRNA测序在科水平上常见细菌分类群的系统发育组成，按队列中丰度最高的Bacteroidaceae进行排序(n=74)。(B)应答者(responders,R)和无应答者(non-responders,NR)中Prevotella和Bacteroides相对丰度的比例。(C)对Prevotella (左)和Bacteroides (右)丰度高与低的患者进行Kaplan-Meier生存分析。其中，Prevotella高丰度患者18例，低丰度56例，Bacteroides高丰度37例，低丰度37例。(D)针对PD-1/PD-L1抗体治疗响应好和不好的患者菌群的a多样性。(E)利用Bray-Curtis聚类算法对粪便样本(n=74，包括45名应答者和29名无应答者)进行PCA分析。

3 不同临床响应患者肠道菌群的丰度差异

研究肠道微生物及其与人体宿主密切关系的一个重要方向是开发用于诊断或预测患者预后的基于微生物的生物标志物。不同临床响应组间的细菌差异可以识别临床相关的微生物物种作为潜在的生物标志物。同时，本研究为减少其他干扰因素，排除了任何与一个或多个因素呈显著相关的菌属，这些因素包括年龄、性别、BMI、癌症类别、MSI等其他因素。该研究根据差异分析确定了10个OTUs在免疫治疗应答者中显著富集，6个OTUs在免疫治疗无应答者中显著富集(图3A)。其中，Ruminococcaceae, Prevotella和Lachnospiraceae在治疗应答者中富集程度最高，而在治疗无应答者中，Bacteroides, Catenibacterium以及 Ruminococcaceae_NK4A214_group的丰度较高。

此外，该研究还检测了每种消化道肿瘤类型中的差异菌属。在大肠癌中共鉴定出23种OTUs，其中Lachnoclostridium, Parabacteroides, Lachnospiraceae,Ruminococcaceae, Flavonifractor (Eubacterium)和 Dialister在治疗响应者中富集，而Bacteroides,Parabacteroides, Coprococcus和Subdoligranulum则在治疗不响应者中富集(图3B)。在食管癌中，共有21种显著差异的OTUs，其中11个在应答者中富集，10个在无应答者中富集(图3C)。在胃癌患者中，有8个OTUs在应答者中显著富集，包括Prevotealla, Bifidobacteriu和Lachnospiraceae, 6个OTUs在无应答者中显著富集(图3D)，包括Megamonas,  Butyricimonas, Lachnospiraceae_UCG-001和Agathobacter。根据不同的肿瘤类型，Bacteroides 和Ruminococcaceae在两个应答组中均有富集，而这两个菌群类别是患者肠道中微生物最丰富的类群之一。因此观察到的不一致可能是由于这两个分类群所属的不同物种造成的。

图3 治疗响应组个体之间的菌群丰度差异。有反应者(R)和无反应者(NR)在(A) 74例患者，(B)结直肠癌患者(19例)，(C)食管癌患者(14例)，(D)胃癌患者(23例)中的丰度变化。所有不同类型的OTUs均有显著性差异(P<0.05)。OTU按R丰度与NR丰度排序。横条的长度代表了每个属在R和NR之间的log₂倍变化。

4 肠道微生物的宏基因组学测序分析

接下来，研究者对74名患者中的25名应答者，15名无应答者进行了宏基因组测序，其中有匹配的16S rRNA测序数据。在基于16S rRNA分析鉴定出的17个显著差异的OTUs中，Prevoella (图4A， Pearson相关，r=0.89)和Bacteroides (图4A，Pearson相关，r=0.92)的OTUs与宏基因组测序数据的OTUs相关。上述相关性也证实了该研究中16S rRNA测序和宏基因组测序结果之间的一致性。此外，研究者使用HUMAnN2来定量识别宏基因组数据中的代谢和生物学途径。根据在应答者和无应答者之间差异路径的等级聚类将患者分为两大组(图4B)，应答率分别为73%和56%。上述区组因素主要是由参与核苷和核苷酸生物合成的途径所构成的。响应者肠道菌群中短链脂肪酸、不饱和脂肪酸生物合成、维生素和淀粉生物合成的发酵途径上显著富集，而非响应者在脂多糖生物合成、糖降解和氨基酸生物合成等途径上更加富集。此外，Eubacterium rectale在应答患者中主导了岩油酸盐的生物合成途径(图4C)，其丰度在治疗应答患者中明显更高(图4D)。而Eubacteriumrectale以其产丁酸盐的能力而被研究者所熟知，并与富含纤维的饮食密切相关，也是为数不多的含有cBirl抗原的物种之一，而这种抗原对肠道反应性T细胞的应答有关。

图4 宏基因组测序对患者肠道微生物进行功能分析。(A)对40名16S rRNA和宏基因组测序样本匹配的患者的Prevotella (上)和Bacteroides (下)丰度的Pearson相关性。(B)利用宏基因组学测序数据进行功能分析。(C)细菌种类对岩油酸生物合成的贡献度，根据25个响应者(R)和15个非响应者(NR)分组。(D)从宏基因组学测序数据中分析R和NR中Eubacterium rectale的相对丰度变化。

5 利用肠道菌群预测模型对患者进行分层

    相关研究已经确定了从PD-1抗体免疫疗法中受益的黑色素瘤患者中显著富集的肠道共生菌。尽管如此，根据患者所属队列的不同，差异的细菌种类也不尽相同。因此，该研究试图确定在其队列中治疗应答者的核心菌群差异标志物，然后在另外一个独立的黑色素瘤队列中进行验证。因为无论肿瘤类型如何改变，肠道细菌都会系统性与宿主免疫系统发生相互作用。为了评估患者在接受PD-1/PD-L1抗体治疗后对微生物产生的即时影响，本研究去除了13名仅保存有治疗前粪便样本的患者，对于其余61名患者初次治疗后样本用于所有后续分析。研究者分别从两个独立的研究(Matson et al. 和Gopalakrishnan et al.)中获得了16S测序数据。在所有三个数据集中观察到的OTUs(隶属于90个属)的相对丰度被保存下来，以建立机器学习模型(图5A)。在这两项黑色素瘤研究中，研究者分别在队列中验证了模型的准确性。正如预期的那样，在上述两个独立队列任一数据集或联合数据集上的准确度(平均准确度=0.49)远远低于胃肠道肿瘤患者队列(平均准确度=0.86)，而在Gopalakrishnan等人队列中的患者中的准确度(平均准确度=0.60)则明显更高(图5B)。

    为了克服Gopalakrishnan队列(29名应答者，11名无应答者)中的不平衡类别，研究者进一步生成了两个基线模型。然而，只有ExtraTrees模型(训练集不同子样本上的随机决策树)和基于弹性网络的模型比基线模型预测性能更好。非多项式特征的弹性网络模型优于其他非参数模型(图5C，AUC=0.78)。在弹性网络模型中排名最高的20个预测菌属中，大多数(15/20)属于Firmicutes门，其中Ruminococcaceae,Lachnospiraceae, Bacteroides,和Catenibacterium具有最显著的预测性能，表明它们可能在PD-1/PD-L1抗体治疗中发挥积极作用，且不依赖于具体的癌症类型。

图5 利用肠道微生物作为生物标记物预测临床响应并与黑色素瘤患者进行比较。(A)在我们的队列和两项接受PD-1抗体治疗的患者的独立黑色素瘤研究队列中确定的细菌类别。上述两项研究包括40名患者和43名患者的粪便样本。Venn图中的数字表示每个区域的种属。在三个数据集中共监测到90个属。(B)根据胃肠道癌症患者的分类特征训练的各种机器学习模型的准确性。蓝色代表交叉验证准确性；橙色、绿色和红色条表示黑色素瘤患者队列中测试的准确性。(C) 来自Gopalakrishnan等人对40例黑色素瘤患者预测性能的ROC曲线，使用与胃肠道癌症患者一致的训练模型，条形图显示每个模型的AUC (曲线下面积)。

该研究报导了接受PD1/PD-L1抗体免疫治疗的胃肠道肿瘤患者的肠道菌群变化。在免疫治疗响应者中，该研究发现患者肠道中Prevotella/Bacteroides的比率升高，同时Ruminococcaceae和Lachnospiraceae的相对丰度显著富集。产生SCFAs的共生菌在预后良好的患者中比例显著升高，包括Eubacterium, Lactobacillus和Streptococcus。此外，基于胃肠道肿瘤的分类特征，该研究构建了的机器学习模型，用于预测胃肠道癌症患者和黑色素瘤患者对PD-1/PD-L1抗体免疫治疗的响应性。

胃肠道肿瘤作为常见癌种之一，尽管在过去十几年中其治疗手段有所改进，但胃肠道肿瘤的死亡率仍然较高的，尤其是在胃癌、食管癌和结直肠癌(colorectal cancers,CRC)。其中，胃癌的5年总生存率(overall survival,OS)只有20-30%。靶向PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitor, ICI)的治疗已在临床上许多癌症中取得重大突破，包括晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌(non-small-celllung cancer, NSCLC)和肾细胞癌(renal-cell cancer, RCC)。FDA在2017年批准了Pembrolizumab用于治疗局部复发或转移的胃或胃食管交界腺癌。同时，相关临床试验正在开展，以评估PD-1/PD-L1抗体免疫治疗在胃肠道肿瘤中的安全性和有效性。然而，只有一小部分患者能从ICI的治疗中真正受益(10-40%)。近年来，研究者逐渐揭示了人体肠道微生物与PD-1/PD-L1抗体治疗的临床响应之间的联系。越来越多的证据表明，肠道微生物针对在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和尿路上皮癌的ICI免疫治疗中起着重要作用。

在生理条件下，肠道微生物有助于维持肠道屏障和免疫稳态，还可能通过肿瘤抗原性促进抗肿瘤免疫监测。肠道菌群或其相关代谢产物可以通过模仿肿瘤抗原，并使T细胞在迁移到远端淋巴结之前被激活。此外，菌群还可以通过模式识别受体(patternrecognition receptors, PRRs)触发系统的先天免疫反应，从而激活宿主对肿瘤细胞的反应。因此，有效识别出直接或间接诱导抗肿瘤活性的细菌对于发展基于微生物的联合治疗以提高PD-1/PD-L1抗体治疗的总体应答率至关重要。然而，临床上治疗应答者和无应答者中核心的差异菌群在不同研究中差异较大，甚至在不同的患者队列中出现相互矛盾，即使在同一肿瘤类别中也时有发生。

本研究首次报导了接受PD-1/PD-L1抗体治疗的胃肠道癌症患者的肠道菌群变化。在该研究队列中，无论患者的临床响应如何，其肠道微生物主要由Bacteroidetes和 Firmicutes构成。其中，在临床响应较好的患者中，Prevotella/Bacteroides的比率升高了2.5倍，在一个应答者的亚组中，其肠道中Prevotella的丰度更高。宏基因组学分析表明，与核苷和核苷酸生物合成、脂质生物合成、糖代谢和SCFAs发酵相关的途径显著影响了临床治疗结果不同的患者肠道微生物功能的差异。此外，该研究进一步确定了在本研究队列和独立的黑色素瘤队列中，基于菌群建立的生物标记物在区分患者不同分层上的有效性，为后续开展靶向微生物联合治疗以及建立微生物来源的诊断标志物用于胃肠道肿瘤的诊断和治疗提供了重要依据。