原名：Influence of probiotic supplementation on the developing microbiota in human preterm neonates

译名：补充益生菌对早产儿微生物群发育的影响

期刊：Gut Microbes

IF：7.74

作为纵向观察性研究的一部分，我们收集2016年1月至2018年每周在亚琛工业大学新生儿重症监护病房住院的早产儿的粪便。

2016年1月至2016年5月，对孕龄小于32周的新生儿每日补充益生菌，包括嗜酸乳杆菌(ATCC 4356)和长双歧杆菌婴儿亚种(ATCC 15697)，随后被称为婴儿双歧杆菌。

2016年5月，该益生菌不再商业化供应，不得不停止补充(对照组)。2017年1月起，由嗜酸乳杆菌La-14 (ATCC SD5212)、长双歧杆菌亚种longum Bl-05 (ATCC SD5588)组成的另一种益生菌混合物随后被称为B.lactis(益生菌2 [P2]组)引入并给予早产儿。两种益生菌产品的补充持续到月经后36周。从80例早产儿中选择174份粪便样本。对照组、P1组和P2组早产儿的中位孕周分别为29、30和26周，新生儿多为剖宫产。

为进行组间比较分析(P1组、P2组和对照组)，将样本按以下四个年龄窗进行聚类:出生后第1周，第3–4周，第7–9周和第10–12周分别对应于补充益生菌的“之前”（T0），“期间”（T1），“之后”（T2）和“之后很长时间”（T3）（图1a）。通过V3-V4 16SrRNA基因扩增子测序对粪便样本进行分析。随后，评估益生菌给药如何随时间（T1-T3）影响特定的内源细菌类群。定量监测停药后益生菌的定殖和存活能力。

1 益生菌的补充会影响生命早期的微生物群组成

为了评估新生儿肠道微生物组的总体组成差异，通过V3-V4 16S rRNA基因扩增子测序对粪便样本进行分析。经过质量过滤后，每个样品总共保留7,708,120个序列，中位数为21,113个（范围为7,727-72,816个）读数，并分配给4,981个扩增子序列变体（ASV）以进行后续分析。粪便中微生物的丰富度随着年龄的增长而逐渐增加（对照组，P1和P2组分别线性回归p <0.0001，p = 0.01和p = 0.0021），但对照组和益生菌组之间无显着差异（图1b）。正如预期的那样，在开始补充益生菌（T0）之前，三组之间的总体微生物群落组成没有显着差异。相反，在补充益生菌时，对照组和两个益生菌组之间的微生物组成存在显着差异（图1c）。在鉴定和纠正潜在的混杂因素（如进食类型，败血症，抗生素的使用和胎龄）后，微生物群落结构的变化仍然存在。值得注意的是，从分析中去除所有益生菌特异性ASV后，对照组和两个益生菌组之间也存在显着差异。这表明观察到的变化不仅是通过口服益生菌补充剂添加到肠道菌群中的直接结果。此外，与对照组的婴儿相比，在T1接受益生菌补充的新生儿个体间差异较小，因此菌群组成更均一（图1d）。虽然在随后的时间点没有检测到后一种影响，但在停止益生菌补充后，短期(T2)和长期(T3)内，全身微生物群落结构的显著差异仍然存在(图1e & f)。与对照组相比，两个益生菌组在补充益生菌（T1）期间收集的样品与两个随访时间点（T2和T3）之间的Bray-Curtis差异均显着较低（图1g，h）。表明补充益生菌可减少时间成分变化，并导致更稳定的微生物群落结构。

图1 补充或不补充益生菌的新生儿的微生物群组成和稳定性。(a)研究大纲信息图(在所有后续队列分析中，每组n = 51-66)。（b）所有组的微生物丰富度（ASV数）均随着年龄的增长而逐渐增加。（c）基于ASV衍生的Bray-Curtis不相似性的主坐标分析（PCoA），在T1时，对照组和益生菌组之间的微生物群落结构存在差异（p <0.001，Permanova）。（d）T1处的T1的Bray-Curtis距离（在组距离内）。（e，f）在T2（e）和T3（f）的对照组和益生菌组之间的PCoA。（g，h）与T1在T2（g）和T3（h）相比的Bray-Curtis距离。

2 益生菌给药对内源性微生物群的特定分类群有影响

随后，评估益生菌给药如何随时间（T1-T3）影响特定的内源细菌类群。首先，确定解释整个菌群结构中大多数变异的菌属是如何与益生菌给药相关的。克雷伯菌、大肠埃希菌、双歧杆菌、肠球菌和肠杆菌是推动三组微生物群落结构分离的主要菌属。通常在未添加益生菌的新生儿中发现克雷伯菌的含量增加。相比之下，接受P2治疗的新生儿的特征是肠杆菌丰度较高，大肠杆菌丰度较低(图2a)。在接受P1的新生儿中，最常见的是双歧杆菌和肠球菌的相对数量增加。

其次，这5个属的分类学随时间的变化表明，益生菌的补充减少菌群组成的时间波动。在对照组中，肠球菌，大肠埃希菌和克雷伯菌的含量很高，而在补充益生菌的新生儿中可以观察到更稳定的模式（图2b）。这种更稳定的模式伴随着P1组中双歧杆菌属的扩张和P2组中肠杆菌属的扩张。最后，线性判别分析显示，双歧杆菌是所有时间点接受P1的新生儿中最富集的属，而乳酸杆菌仅在T1时显着富集（图2c-e）。此外，尽管与P1相似的第二种益生菌在T3处与较高的双歧杆菌丰度和克雷伯氏菌水平相关，但这些新生儿在所有时间点都有较高的肠杆菌丰度，这是与对照组最显著的区别(图2f-h)。值得注意的是，接受P2治疗的新生儿在T1和T2-T3时，肠球菌和大肠杆菌的含量显著下降。此外，在两个益生菌组中，益生菌配方之外的双歧杆菌物种丰度与对照组新生儿相比均有所提高。

图2 益生菌给药后的特定益生菌类群。

3. 停止补充后益生菌的肠道定植

为了定量监测停药后益生菌的定殖和存活能力，建立菌种特异性qPCRs检测给药益生菌。qPCR检测结果证实，与对照组相比，新生儿接受P1处理后B.longum/B. infantis and L. acidophilus 丰度明显更高。接受P2处理后B. longum/B. infantis, B. lactis, L.acidophilus, and L. casei丰度明显更高（图3a-1）。B. longum/B. infantis T2时仍富集，即停止P1补充后，而 B. lactis and L. acidophilus在停止补充P2 (T2)后仍然增加。重要的是，益生菌不会永久定殖，因为在T3时未观察到益生菌与对照组之间的显着差异。但是，在某些（4/11）在T3接受P2的婴儿中仍可检测到乳酸杆菌（图3f）。

图3 益生菌给药与益生菌种类检测的联系。

为了进一步调查益生菌的性质和持续时间，分析16例新生儿在停止补充益生菌期间和停止补充益生菌20周后每周收集的粪便样本。将新生儿分为“持久地”定殖，“短暂地”定殖与不定殖。因此，研究表明P1 (B. infantis)中的益生菌双歧杆菌在停用后会持续在大多数儿童的肠道中定居，而P2中的B. longum的这一比例则有所下降(图4 a-b)。另一方面，几乎所有接受P1的新生儿都没有嗜酸乳杆菌，而在大多数接受P2补充的新生儿中，嗜酸乳杆菌仍然存在(持续或短暂)(图c4 -d)。添加P2的新生儿中也表现B. lactis和干酪乳杆菌的持续存在，但大多数新生儿对这些益生菌的检测呈阴性(图4e-f)。在一些儿童中，双歧杆菌和干酪乳杆菌的定殖在停止益生菌补充后持续长达15周。

图4 停止补充后被益生菌定殖。

4 丰富的病菌和预防坏死性小肠结肠炎

由于这些变化可能会对改变的微生物群的不良影响起到保护作用，接下来研究补充益生菌对坏死性小肠结肠炎(NEC)发生率的影响以及临床相关抗菌药物耐药性(AMR)基因的存在。尽管在我们的研究期间NEC的总体发生率较低(n = 10)，但与对照组相比，补充P1或2的新生儿的发病率显著降低(图5a)。值得注意的是，在没有NEC的新生儿中只有低含量的肠球菌，从T2年的对照组中可以看出，克雷伯菌是最主要的类群(图2b)。

为了进一步阐明益生菌在此的作用，考虑到数据的组成性质，进行SparCC相关网络分析。有趣的是，补充双歧杆菌和乳杆菌的益生菌均与NEC-病原菌肠球菌的含量有关。在接受P1的新生儿中，双歧杆菌和乳杆菌呈正相关。乳酸杆菌又表现出与肠球菌的直接负网络相关性（图5b）。在接受P2的新生儿中，双歧杆菌和乳杆菌与肠杆菌呈正相关，而肠杆菌又与NEC-病原性肠球菌呈负相关（图5c）。

由于给药益生菌可降低早产儿肠球菌、大肠杆菌和克雷伯菌丰度(图2c-h)，益生菌还可降低耐药菌株的流行率。耐药菌株的存在严重阻碍感染事件中有效的抗菌治疗。肠球菌可以带有vanA和vanB抗性基因，赋予对糖肽抗生素（例如万古霉素和替考拉宁）的抗性。肠杆菌科，例如大肠埃希菌和克雷伯菌，可以编码广谱β-内酰胺酶（ESBLs），赋予大多数β-内酰胺抗生素耐药性。因此，我们调查了vanA和vanB以及最普遍的ESBL（CTX-M组1、2和9）基因的存在。然而，通过添加益生菌，这些抗生素抗性基因的发生率并没有显着改变，这可能是由于所分析人群的肠道菌群中抗生素抗性基因的总体存在率较低。

图5 摄入益生菌可通过干扰病理细菌预防坏死性小肠结肠炎。

通过每周的粪便采样和临床监测，我们的研究是一项纵向观察研究，分为三组，一组未接受治疗的儿童(对照组)和两组接受两种不同益生菌补充剂(P1和P2)的儿童。尽管不同组在连续的时间段内取样，但纳入研究的所有患者的标准医疗护理方案(除补充益生菌外)、医疗和护理人员以及新生儿重症监护病房(NICU)环境和医疗设备均相同。值得注意的是，连续时间周期的微生物群落结构分析没有发现明显的季节效应或NICU环境中益生菌菌株或细菌的交叉污染。

与之前在成人和婴儿中进行的许多研究相反，我们显示几种益生菌株在停止补充时的持久性。给予婴儿B. infantis停止用药后，大约四分之三的新生儿持续服用3-15周，然而，观察到的乳酸菌菌株的持久性较少。与乳酸菌相比，双歧杆菌这种优越的持久性也在其他一些研究中被观察到。这种差异持久性的机制很大程度上尚不清楚，但肠道环境、给药菌株的特征以及它们的竞争适应性可能都有影响。有趣的是，我们检测到两个补充益生菌配方之间益生菌细菌丰度的差异，这表明物种或品系差异或共同施用的益生菌菌株的影响。例如，与对照组的新生儿相比，接受P2的新生儿在停止补充后，B. lactis 而非 B. longum仍显着富集。此外，与补充P1的新生儿相比，接受P2的新生儿嗜酸杆菌持续存在。

先前的报道表明母乳具有促进双歧杆菌作用。这种效应在很大程度上是由母乳低聚糖(HMOs)驱动的，HMOs是一种结构多样的未共轭聚糖，在母乳中含量很高，但在配方奶粉中却不存在。HMOs起着益生元的作用，并促进双歧杆菌的生长。母乳喂养也可能因此促进以益生菌形式施用的双歧杆菌菌株的定殖。这可以解释所施用的益生菌婴儿双歧杆菌菌株的明显定殖，这是我们研究中已知的HMOs利用者。虽然本研究中研究人群的规模不能分析母乳喂养和益生菌定殖功效之间的可能联系，但未来的调查应该解决这个有趣的和临床相关的问题。

即使在从测序数据中去除益生菌的ASVs后，给药益生菌显著改变了肠道菌群的组成。因此，给药益生菌直接或间接影响内源性菌群，这与其他研究的结果一致。最值得注意的是，虽然细菌丰富度和多样性未受影响，益生菌的处理显著减少个体间的变异和时间微生物群的变化。新生儿，特别是早产儿，在出生后早期表现出较高的个体间差异和肠道微生物群组成的重大波动。较高的个体变异和成分波动可能导致抗逆性和定植抗性下降，因此更稳定的微生物群组成可能保护免受致病成分变化的影响。此外，早产菌群通常由病理细菌主导，如大肠杆菌、肠杆菌和克雷伯氏菌，它们产生有效的免疫调节分子，如内毒素和菌毛，并经常携带赋予抗生素耐药性的基因。减少这些细菌可能会降低不适当的炎症或全身感染的风险。在这方面，未补充益生菌的早产儿中，克雷伯菌是推动全身微生物结构的主要细菌之一，但在补充益生菌的儿童中，克雷伯菌对整体微生物结构没有贡献。这一观察结果与Alcon-Giner及其同事的研究结果一致。

如预期的那样，补充益生菌可导致双歧杆菌和乳酸菌富集。然而，这并不局限于益生菌双歧杆菌和乳酸菌种类的富集。根据另一份最新报告，益生菌双歧杆菌物种的施用促进了内源性双歧杆菌物种的生长，例如短双歧杆菌，双歧杆菌和动物双歧杆菌。根据另一最新报告，益生菌双歧杆菌物种的施用促进内源性双歧杆菌物种例如短双歧杆菌，双歧双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长。属内物种之间的交叉进食或肠道环境的诱导适应可能对此有所帮助。相比之下，益生菌治疗的婴儿的病原体如克雷伯菌或大肠埃希氏菌以及梭菌和肠球菌减少。这些结果在很大程度上是一致的，尽管与其他研究中所描述的观察结果并不相同。尽管肠球菌和肠杆菌科（克雷伯菌和大肠埃希菌）的数量减少，但在补充益生菌的新生儿中，编码万古霉素抗性和ESBLs的基因的患病率并未降低。这些发现与先前的研究形成对比，先前的研究观察到非益生菌早产儿的粪便中有ESBL基因，而经益生菌治疗的早产儿则没有。先前的临床和动物研究表明，肠道微生物群与未成熟的粘膜组织共同参与NEC的病因。因此，在疾病发生之前，微生物群组成的变化是可以预料的。对出生后定期对早产儿进行取样的一些人类队列研究报告健康婴儿和NEC婴儿的肠道微生物群组成。但是，没有发现明确预测疾病发作的特定病原体，病原体或微生物群特征。值得注意的是，研究期间几乎所有记录的NEC病例都发生在对照组的新生儿中，证实补充益生菌具有显著的保护作用。对于三名NEC患者，在疾病发作之前可以连续取样。这三者在疾病发作之前均表现出肠球菌丰度的显着提高。在其他研究中，肠球菌或与肠球菌相关的次级代谢产物基因簇也增加。此外，在一个啮齿类NEC模型中，某些粪肠菌菌株已被证明会增加组织病理学。本研究中的两名患者也表现出克雷伯氏菌丰富度增强，在几项研究中，克雷伯氏菌与NEC风险增加有关。此外，NEC发病前肠杆菌科的丰度有所增加。与预期的一样，肠杆菌科成员(Escherichia和Klebsiella)的丰度也在NEC诱导的肠道炎症中增加。尽管益生菌预防NEC的机制尚不清楚，但我们的结果与其想法相符。可能包括肠微生物群对外源刺激的适应力增强，病原体的减少或对宿主发育中的肠组织和粘膜免疫系统的间接免疫调节作用。

考虑到新生儿肠道内的细菌总数估计为10⁶-10¹²，因此每天要补充10⁹种细菌。鉴于早产儿的肠道组织和粘膜免疫系统不成熟，对全身细菌感染的敏感性很高，因此需要仔细考虑口服活菌的潜在风险。早产儿因口服益生菌引起全身感染的病例已被报道。在本研究中，未观察到在研究期间服用益生菌的不良反应或感染。综上所述，我们的结果表明口服益生菌对全身微生物群落结构和特定类群的丰度有显著影响。该数据强调肠道菌群建立的独特的婴儿期，并建议补充益生菌对早产儿有益。