编译：雪花飘飘，编辑：小菌菌、江舜尧。

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在这篇综述中，作者回顾了传统分离和培养方法的水平和局限性，并概述和讨论了最近的创新技术，这些技术有可能提高从研究不足的群体中分离、培养和鉴定微生物的能力。此外，作者还强调了最近在培养难以捉摸的微生物方面取得的成功，并列出了一些微生物的例子，以便在今后的栽培尝试中优先考虑。

为了提高对未培养的古细菌和细菌多样性的了解，必须提高将环境中的微生物带入培养基的能力。（表1）。

表1 可被视为培养关键目标的微生物的主观概述

1 近期成果培养案例

经典的培养策略和方法

2 未培养的多数微生物

生命之树，可以说是生物学中最重要的概念之一。当代最受支持的关于生命树结构的想法是将原核生物分为两个主要的结构域，即古菌和细菌。根据16SrRNA基因序列数据，已计算出古菌和细菌物种总数约为40万种，包括约60,000属，尽管对地球上考古和细菌物种的实际数量的估计可能超过这一数字几个数量级。在这些物种中，97%只属于四个细菌门(拟杆菌，蛋白质细菌、硬壁菌和放线杆菌)(图1)。相反，所有其他细菌门，以及整个古菌，都很少有培养物种来表示（图1，2）。

图1 培养的细菌偏向于细菌、蛋白质细菌、纤维菌和放线菌

图2 考古菌多样性以未培养群体为主

3 影响可培养性的因素

3.1 基质和生长条件的鉴定

在某些情况下，培养特定微生物所需的底物、供体和受体或其他培养基成分可用于富集和/或分离特定菌株。此外，许多微生物的培养严格依赖于特定的环境条件以及各种生长因子（如维生素、氨基酸、核苷酸、无机化合物、腐植酸或其他外部电子梭）的存在，这些因素通常很难识别，因此在实验室中难以模拟。一些无机化合物（金属、硫和氮化合物）也参与了隐蔽循环，尽管它们在生物地球化学循环中很重要，但它们在环境中的浓度可能低于检测限。

3.2 休眠的复苏

由于目前未培养的微生物中有很大一部分生活在可能由持久性微生物控制的环境中，休眠的复苏是微生物培养工作中的一个重要障碍。微生物可能进化出了不同的调节休眠的机制，这就认为不太可能存在一个统一的解决方案来使它们从休眠状态中复苏。因此，这种潜在的变异性可能是培养研究中的难点。

3.3 共生的相互依存关系

在某些情况下，基本分子或电子（包括微生物产生的电子梭，如H2和甲酸盐）在微生物群落的成员之间直接交换，在种间依赖通常被称为共生（或“共营养”，如果两个有机体依靠对方降解底物来克服热力学限制）。在共生或共营养微生物的情况下，使用能够共同分离两个微生物伙伴的方法，例如以组合方式进行细胞分选，可能有利于建立稳定的共培养。

3.4 物理接触或空间邻近性

共生或共营养伙伴之间的物理接触或空间邻近性似乎是微生物生长的一个重要因素，这表明在透析膜分离的隔间中生长的微生物伙伴的生长速度低于在一起生长的微生物伙伴，这限制了这种系统在微生物分离中的应用。

3.5 理化环境条件

物理化学环境条件，如温度、pH、盐度和氧化还原条件，也是微生物培养的重要决定因素，而且所有这些因素在自然环境中都可以在微尺度距离上发生剧烈变化。在微生物群落中，一些微生物有助于使环境条件对其他微生物有利，这使得依赖这些效应的微生物的分离变得复杂。同样，严格厌氧微生物的培养也有技术上的要求，特别是现代高通量技术涉及细胞分选和在微滴定板中生长。在厌氧帐篷或手套箱中工作通常是厌氧微生物富集和培养的最方便的解决方案。然而，在这些环境下，尽管通过安装空气过滤装置可以减少污染的可能性，但无菌条件很难维持。

3.6 低丰度和低竞争

许多原核生物在自然界中以低丰度存在于复杂的微生物群落中，但仍可能对某些过程产生重大影响。其中一个可能的原因是底物降解的代谢率和生长速率之间没有必然的联系。这意味着，在某些情况下，一种低丰度的微生物可能比另一种在同一环境中生长速度更高的微生物代谢底物的速度更快。慢生长微生物定向培养的另一个困难是研究的时间跨度长，微生物的生长速度会受到实验室提供的次优条件的影响，并且与环境中的“自然”生长速率有很大的不同。尽管通过优化生长条件可以提高生长速度，但考虑到延长的时间范围和增加的相关研究成本，缓慢生长的微生物可能已不作为优选。

4 创新技术

大多数提高微生物分离率的方法遵循两种主要策略中的至少一种（图3）。

（1）依靠增加细胞隔离的数量来提高分离感兴趣物种的机会（高通量分离和培养），

（2）选择性地分离具有特定功能特征或属于特定分类群的生物体（靶向分离）。两类方法描述（图4）

图3 使用高通量或靶向方法分离新微生物的工作流程

图4 新微生物分离和培养的创新方法

4.1 基于膜扩散的培养

具有高通量培养实验能力的基于膜扩散的技术是（隔离）芯片（及其衍生物），它由一个容纳一系列小孔的平板组成，这些小孔作为微型腔室从环境样本中捕获和分离单个细胞。这些孔用一层膜密封，然后整个装置在最初取样细胞的环境中孵育，为分离细胞的生长提供原位条件。这种扩散培养设备已被用于促进系统发育新物种的生长，而不仅仅是那些使用传统培养方法从相同环境中恢复的物种。

4.2 培养用微流体系统

微流控系统广泛应用于各种生物研究应用，包括培养。一般来说，这些系统的好处包括通过使整体实验装置小型化而提高可扩展性，从而提高吞吐量，以及能够并行地、在一系列底物存在下或在不同的物理化学条件下操纵环境样品中的大量单细胞。在某些情况下，这些好处也可以扩展到厌氧微生物的培养，因为有些系统可以保持低水平或没有氧气。

4.3 细胞分选分离和分类、功能选择

细胞分选技术是许多生物学研究领域的主流技术，可用于从混合群落的细胞悬浮液中分离单个细胞。细胞分选可以用许多不同的技术来进行，其中一些技术可以高速进行，例如商业上可以买到的基于液滴的和基于微流控的分拣机。其他技术，如显微镜引导的光镊，可以精确地操纵和分离单个细胞，但吞吐量较低。

荧光活化细胞分选（FACS）是一种基于荧光信号的细胞分选方法。尽管有些生物体具有固有的荧光特性（自体荧光），但一些低毒或无毒的荧光染料也可用于染色不同的细胞靶点，如DNA和磷脂膜，使细胞更容易与荧光背景水平区分开来。

FISH是一种广泛应用的荧光标记方法，它可以用来识别和量化特定样本中属于特定分类群的细胞。鱼类标记的细胞样本也可以用流式细胞仪进行分类，以丰富属于特定分类群的细胞，进行测序研究。

最近的一项技术是反向基因组（图5），它弥补了非分类群特异性细胞染色剂和高度类群特异性但通常具有破坏性的鱼类之间的差距。这项技术利用了基因组解析的宏基因组学从环境样本中重建未培养微生物的接近完整基因组序列的优势。

拉曼活化细胞分类提供了一种替代荧光标记的方法和一种分离活细胞的方法，同时选择在某些条件下最活跃的细胞，从而对应于特定的生态功能。

图5 反向基因组学用于靶向分离和培养新型微生物

4.4 限制性

（1）形成生物膜的微生物在分离细胞分类时可能具有挑战性。

（2）同样，许多微生物是从环境中取样的，如沙子、土壤、沉积物和粪便材料，这些环境中含有可能干扰分子标记和基于流动的方法的非生物颗粒。在这些情况下，细胞需要在分离前与颗粒分离，而实现分离的程序。

（3）如果与厌氧微生物一起工作，是必须在缺氧条件下进行分离实验。

（4）高通量培养方法的另一个困难是提供气体底物，如H2、CO2、CO和CH4。

（5）单靠基因组序列往往无法提供足够的数据来准确确定成功培养特定微生物所需的所有培养条件。

5 筛选方法

5.1 直接可视化

固体培养基上观察到的菌落形成表明存在活性细胞，使用商业菌落采摘机器人可以提高菌落分类筛选和再接种的速度。然而，一些在实验室培养的古生菌和细菌可能只达到如此低的最大细胞密度，以至于无法用肉眼观察到。如果细胞非常小和（或）透明，那么用光学显微镜观察细胞的尝试也可能失败，并且对于高通量装置来说可能很费力。用荧光活性染色剂染色并用荧光显微镜观察，可以使细胞更加明显；然而，如果没有观察到细胞，仍然很难自信地排除样本中微生物的生长。

5.2 生长的光学检测

光分光光度计读片器可用于在多孔板的单独孔中对液体样品进行光密度测量，从而确定以可伸缩、高通量方式指示生长的增加的细胞密度。然而，这种方法可能不适合每细胞密度较低或只生长到较低种群密度的物种。光密度测量也不能准确显示液体样品中存在的细胞数量。另一种更为敏感的方法是流式细胞术，它可以用来有效地筛选生长情况，也可以从几十微升的培养物中量化细胞数量，从而为进一步的实验保留更大的体积。许多流式细胞仪是自动化的，因此它们可以筛选和量化在多孔板的单独孔中生长的几种培养物，使其适合处理大量液体样本，例如通过高通量稀释至消光实验产生的样本。

5.3 基于PCR和测序的筛选

一旦在大规模实验中确定了可行的菌落或培养物，就可以筛选出感兴趣的物种。如果目标物种数量有限，用针对目标物种的特异性引物进行PCR是一种有效且可扩展的筛选方法。在某些情况下，PCR可以只使用培养物的一小部分样本作为输入，通过PCR的初始变性步骤（通常为~95–98℃）裂解细胞并释放DNA进行扩增。然而，对于许多坚固的细胞类型，需要更复杂的裂解方法。

5.4 MALDI-TOF质谱

MALDI-质谱法是鉴别抑制剂的另一种方法。这种方法已被证明是快速和经济有效的，以确定分离株，同时过滤出同种和非目标分类群。由于MALDI-TOF质谱法具有很高的灵敏度，因此只需要相对较低的细胞质量就可以记录质量剖面，以便进行分类鉴定。

6 培养目标

一个环境高丰度的类群可能在该环境的生物化学中扮演着重要的角色，如Bathyarchaeota、各种海洋类群古生菌、酸杆菌、SAR202和SAR86（表1）。识别符合这一特征的微生物相对简单，可以根据公开的16S rRNA基因扩增子数据估计特定群体的丰度，或者可以重新为个别环境生成丰度。

最终，深入的知识和特定主题的优先事项将有助于研究人员确定可能对培养工作最有回报的目标。

微生物分离和培养的广泛需求导致了许多创新方法的发展。这些方法大多采用有针对性的（例如，反向基因组学、拉曼活化细胞分选和FISH）或高通量（例如，iChip、SlipChip和纳米孔微型微生物培养）策略来从菌群和环境中分离细胞，尽管有些方法在不同程度上综合了这两种策略。

基于目前可用的方法，作者只能培养代表微生物多样性现有研究的一小部分微生物。因此，培养新的微生物，需要先进的培养技术进一步发展和成熟。在这篇综述中讨论的创新方法很好地代表了一个未来的成功培养革命的途径。

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