编译：微科盟咖啡里的茶，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 微生物群落调控过程分析

确定了W值（利用强度）变化的浓度节点，结果总结在图1中。在整个胁迫期间，随着镉浓度的增加，7个培养周期的累积W值先增加后降低。土壤微生物在100 mg kg^-1胁迫下达到最大值(12.242)，在250 mg kg^-1胁迫下达到最小值(9.701)。蚯蚓体内的微生物在100 mg kg^-1胁迫下也达到最大值(12.700):12.700，但在125 mg kg^-1胁迫下最低值为11.356。从不同培养周期的W值来看，培养后期土壤微生物的W值普遍高于培养前期，单位培养周期的最大W值出现在96 h和144 h。从图1可以看出，除250 mg kg^-1胁迫组外，蚯蚓体内微生物最大W值的培养时间随镉浓度的增加而缩短：50 mg kg^-1的胁迫组出现在168 h，100 mg kg^-1的胁迫组出现在120 h，125 mg kg^-1的胁迫组出现在96 h，500 mg kg^-1的胁迫组出现在48 h。

图1. 暴露浓度的W值汇总图（t1-t7为培养时间，单位为天）。

2 微生物群落的功能基因分析

基于我们研究小组先前的时间节点发现结果和本研究中的浓度节点发现结果，对第二和第三调节阶段的蚯蚓样品和土壤样品进行宏观基因测序。蚯蚓样本分别标记为E1和E2；土壤样本分别被标为S1和S2。去除蚯蚓的宿主序列后，进行生物信息学分析，探讨镉胁迫下蚯蚓体内外微生物群落的代谢机制和调控功能基因。此外，选择第一(标记的Sa)和第五(标记的Sb)调控阶段的土壤样品进行宏观基因测序分析，以确定镉暴露后土壤微生物功能基因的变化。

2.1 蚯蚓微生物群落的功能基因分析

2.1.1 蚯蚓中微生物的种类组成和丰度

去除宿主(E. fetida)的基因序列后，通过MetaPhlAn2软件分析剩余序列，获得微生物的物种组成和丰度信息并总结在表2中。从表中可以看出，E1样品中95.602 %的序列属于变形杆菌（Proteobacteria），其中90.902 %为蚯蚓状肾杆菌（Verminephrobacter），4.700 %为埃希氏菌（Escherichia）。其余4.398 %为丙型反录病毒属（Gammaretrovirus）。

在E2中，病毒领域序列增加到26.002 %，细菌界序列减少到73.997 %，表明随着胁迫时间的延长，镉的毒性程度增加，并对微生物中的一些细菌产生抑制作用。表2显示被抑制的细菌属于蚯蚓状肾杆菌（Verminephrobacter），其丰度下降到52.705 %。同时，E2样品中埃希氏菌（Escherichia）的丰度基本保持不变，但出现了占丰度16.665 % 的假单胞菌（Pseudomonas），。在病毒界中，丙型反录病毒属（Gammaretrovirus）的丰度达到15.462 %，正肝病毒（Orthohepadnavirus）以10.540 %的丰度出现。

2.1.2 蚯蚓体内微生物的代谢途径分析

在去除E. fetida的宿主基因序列后，E1样品中剩余13个基因，E2样品中剩余42个基因。基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）生物学的通路统计数据库，从复杂调控网络的角度对蚯蚓中的微生物基因进行了生物学途径富集分析。结果表明，E1和E2样品都具有两种生物代谢途径:环境信息处理和人类疾病。不同的是，E2的人类疾病途径包括两个子途径:内分泌和代谢疾病以及传染病，而E1只有传染病子途径。此外，E2中还有未分类的基因信息加工途径。关于在途径中的调节基因，E1和E2中主要的调节基因是HBA基因，而ABCA3基因和NEUROD1基因也出现在E2样品中。

2.2 土壤微生物群落的功能基因分析

2.2.1 土壤微生物的物种组成和丰度

土壤微生物种类组成和丰度信息见附表3。在S1样品中鉴定出63种微生物，其中细菌占94.891%，病毒占5.109%，分属5门10纲17目23科。S2样品共鉴定出91种微生物，其中细菌占97.825%，病毒占2.169%，古细菌占0.005%，分属7门15纲26目36科。Sa样品共鉴定出56种微生物，其中细菌占97.429%，病毒占2.571%，分属6门10纲15目22科。Sb样品中鉴定出84种微生物，其中细菌界占98.154%，病毒界占1.846%；它们分属于4门8纲22目34科。

表3显示了土壤样品中每个微生物群落中丰度大于1%的分类群。在样本S1，气单胞菌属（Aeromonas）的丰度最高（43.075%），其次是假单胞菌属（Pseudomonas，23.941%），肠杆菌属（Enterobacter，7.294%）位居第三。它们都属于丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria），累积丰度占74.31%，说明在这种胁迫条件下，Gammaproteobacteria代表了蚯蚓体内的主要微生物，其中Aeromonas最为常见。

在样品S2，虽然Gammaproteobacteria仍有较高的丰度，为64.531%，但不动杆菌（Acinetobacter）也出现了。结合附表3可以看出，S1样本中的Acinetobacter属包含4种，总丰度仅为1.412%；然而，在S2样本中，Acinetobacter含有5种细菌，总丰度为14.795%，其中新种占2.331 %。结果表明，镉胁迫后蚯蚓的微生物种群发生了变化，Acinetobacter微生物新种数量增加以应对胁迫。同时，与S1相比，在丰度水平大于1%上(表3)，S2也出现在无色杆菌属（Achromobacter）和土壤杆菌属（Pedobacter）中，但在病毒界中缺乏丝状病毒属（Inovirus）。

对于土壤样品Sa，从表3中可以看出在细菌界，主要微生物是Gammaproteobacteria的Aeromonas (34.340%)，其次是Enterobacter (15.770%)和Pseudomonas (16.661%)以及β-变形菌类的马西莱氏菌属（Massilia，15.544%）。在样品Sb中，丰度为28.043%的Massilia是最重要的微生物，其次是Aeromonas (22.535%)和Pseudomonas (12.1 18%)。此外，Enterobacter的丰度降低到9.992%。此外，Sb中3.842%的微生物被鉴定为Pedobacter。

在病毒界，只有Hpunalikevirus属的微生物在Sa和Sb中的丰度大于1%；前者2.029%，后者1.300%。结合胁迫时间的变化，这一结果表明在胁迫结束时，病毒界的微生物含量逐渐减少。

2.2.2 土壤微生物代谢途径分析

基因测序的结果和KEGG数据库提供了微生物代谢途径和注释的基因信息(附表4)。从附表4中可以看出，在S1样本中492847个基因被注释为454个代谢途径；在S2样本中545576个基因注释了452条代谢途径；Sa样品中389561个基因注释了427条代谢途径；Sb样品中578458个基因注释了454条代谢途径。从注释基因的数量来看，土壤样品中的微生物随着镉胁迫时间的延长而逐渐增加。

前10种注释最多的生物代谢子途径被选出和总结在表4中。从每个土壤样品中选择的子途径数量相同，而且累积基因注释超过注释基因总数的三分之一。其中，内分泌抗性、转运蛋白和双组分系统的子途径占基因注释的20%以上，达到显著富集水平。这表明尽管土壤微生物代谢途径的种类和数量随胁迫时间而变化，但10种主要代谢途径，包括内分泌抗性、转运蛋白和双组分系统，基本保持不变。就途径中的调节基因而言，附表5显示了一些主要代谢子途径中的调节基因。土壤样品中的主要调节基因是TC.FEV.OM和cheBR基因。前者参与转运蛋白代谢，编码铁复合物外膜受体蛋白；后者参与双组分系统途径并编码CheB/CheR融合蛋白。

表2. 蚯蚓体内微生物的种类组成和丰度。

表3. 土壤中微生物种类组成和丰度(> 1%)。

表4. 土壤样品的代谢和基因注释(前十名)。

1 镉胁迫下蚯蚓微生物群落功能基因的变化

蚯蚓中丰度最大的微生物物种是蚯蚓状肾杆菌属（Verminephrobacter），表明该属与蚯蚓关系密切。这与Viana的一项研究结果相似，该研究发现Verminephrobacter是蚯蚓肾小管中的一种特定共生体，在胚胎发育的早期阶段定居在蚯蚓体内，并通过蚯蚓茧直接传播。Moller等人研究了蚯蚓与Verminephrobacter微生物共生系统的进化史，发现二者长期共生，很少发生宿主转化。然而外部环境因素会影响他们的共生关系。在本研究中，随着镉胁迫的加重，E2样品中Verminephrobacter的丰度降低。KEGG代谢途径分析表明，此时蚯蚓肠道内出现了调节基因ABCA3和NEUROD1，分别参与环境信息加工中的ABC蛋白转运途径和遗传信息加工中的转运因子途径。Davidson等证实了Verminephrobacter具有从环境中吸收特异性游离DNA的能力，并且这种能力受环境因素的调节。其中，Verminephrobacter IV型的突变会导致DNA摄取能力的丧失。因此推测蚯蚓中的NEUROD1基因很可能通过转运因子途径调节Verminephrobacter IV的菌毛突变以应对Cd胁迫。ABCA3基因通过ABC蛋白转运途径促进Cd跨膜转运，从而减缓了镉的毒性作用。大量研究也证实，ABC转运蛋白是真核生物对外界污染胁迫做出反应并产生耐药性的重要原因之一。

细菌界的另一种微生物假单胞菌（Pseudomonas）出现在第三个调控阶段，丰度达到10%以上。推测Pseudomonas在抗镉胁迫中起重要作用。研究证实，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可用于稻田镉污染的修复，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）可显著改善镉污染湿地土壤的营养状况和环境质量。根据物种注释的结果(表2)，该微生物是一种未分类的Pseudomonas物种，表明蚯蚓具有自己独特的参与抗镉胁迫的微生物物种。这一发现也证实了蚯蚓在修复镉污染土壤中发挥着不可替代的作用。

在病毒界中，丙型反录病毒属（Gammaretrovirus）的丰度在调节的第三阶段增加，表明蚯蚓在较高水平的镉中毒后代谢紊乱。原肝病毒（Orthohepadnavirus）出现在这个阶段成为另一种主要微生物。这意味着蚯蚓对体内微生物的驱动作用减弱，产生了有害物质。而且Orthohepadnavirus可能是食肉动物吃了镉胁迫的蚯蚓后患上肝癌的原因之一。除了存在生物富集的重金属和其他污染物外，当蚯蚓被用作药材或人类食物时，我们必须考虑污染物含量和生产场地的属性。

在E1和E2样本中，主要编码生物体中血红蛋白的糖化血红蛋白基因是主要的调节基因。Nishi等人的研究证实，血红蛋白的过度表达减少了由过氧化氢诱导的自由基氧的产生，并增强了其抵抗氧化应激的能力；Datta等人的研究也证实了编码血红蛋白的糖化血红蛋白基因与导致细胞膜损伤的氧化应激机制有关。前期研究表明，蚯蚓尾部组织中的镉毒性相对较高，自由基氧含量也较高。此外，膜脂过氧化的标志-MDA是主要的氧化应激指标。这证明编码血红蛋白的HBA基因是镉胁迫后蚯蚓解毒机制中的关键环节。Khan等人证实，蚯蚓(Lumbricusterrestris)等陆生物种可以通过对血红蛋白的定量和定性影响来限制有氧代谢(氧气提取、运输和利用)的范围，从而耐受生境外部环境的压力。因此，Calisi等人提出蚯蚓中的血红蛋白浓度可以作为一种新的潜在生物标志物来指示土壤中的重金属污染。

2 镉胁迫下土壤微生物群落功能基因的变化

从表3可以看出，随着胁迫时间的延长，土壤中Massilia的丰度从前期的15.544%逐渐下降到中期的8.893 %，并在胁迫后期增加到最大丰度28.043%。由于本研究中的试验土壤是经过灭菌的人工土壤，因此可以确定，在胁迫初期土壤中的Massilia微生物均来自蚯蚓。Byzov等人的结果也表明，Massilia确实是蚯蚓消化道中的共生细菌。许多学者也已经在被重金属污染的采矿土壤、海滩和污泥中筛选鉴定了Massilia微生物，证实Massilia是重金属胁迫环境中重要的抗性微生物。因此，第五调控阶段的耐镉微生物为Massilia(表3)，物种注释结果表明该微生物是一个尚未命名的新物种。

气单胞菌属（Aeromonas）微生物广泛存在于食物链中，通常被认为是导致鱼类疾病和人类腹泻的有害微生物。然而，He从天然气钻井井场周围的污泥和钻井废水中分离出一株Aeromonas，并证实该菌株的胞外聚合物中含有一种可与Cu²⁺复合的分泌物，可提高Cu²⁺的吸附效率，减轻Cu²⁺对其微生物细胞的毒性作用。Sun等的研究结果表明，Aeromonas对Cr⁶⁺、Cu²⁺,Zn²⁺ 和Mn²⁺具有较强的抗性。因此，在Sa、S1和S2，Aeromonas的主要功能是抵抗镉胁迫。同时，从表3可以看出，随着胁迫时间的延长，Aeromonas的丰度变化与Massilia相反。一方面，一些Aeromonas微生物缺乏鞭毛，而大多数Massilia微生物具有鞭毛并具有良好的运动性。在镉胁迫的早期和中期，Aeromonas的微生物起主要作用，而在胁迫的后期，Massilia起抗镉作用。另一方面，Massilia微生物可以分泌环糊精酶，并产生大量的环糊精，其特殊的物理结构可以包含重金属离子，从而“分离”重金属，减少其对蚯蚓的危害。前期研究也证实，环糊精是蚯蚓在镉胁迫后期 (8 - 10天)维持正常生理代谢的重要碳源。此外不动杆菌属（Acinetobacter）的微生物已被证明能显著影响重金属的迁移和转化。

铁复合物外膜受体蛋白和铁载体之间有着密切的关系。铁是生物体正常生理代谢的必需元素。微生物分泌合成铁载体，获得不溶性含铁氧化物或氢氧化物后大量存在于地壳中。Sinha等人发现，在镉胁迫下，假单胞菌（Pseudomonas）产生的铁载体是无镉组的10倍。结合KEGG代谢途径分析结果，推测TC.FEV.OM基因可能通过铁复合物外膜受体蛋白的代谢途径调节Pseudomonas微生物来影响铁载体的产生，从而成为蚯蚓解毒机制的关键部分。Zhang等人证实所选择的具有分泌铁载体能力的Pseudomonas微生物能够显著提高高粱对镉的吸收效率。因此，在镉污染土壤的生物修复和保护人类食品安全方面，Pseudomonas微生物受TC.FEV.OM基因调节，具有潜在的实际应用价值。

双组分调控系统是细菌趋化过程中信号转导的核心。当存在镉毒性时，细菌必须有能力识别镉浓度低的地方，以实施回避运动。目前的研究已经证实埃希氏菌属（Escherichia）的CheB/CheR甲基化-去甲基化系统可以很好地完成这一过程。因此，在本研究中，土壤中含量较高的Escherichia微生物可能通过cheBR基因来调节CheB/CheR系统，以逃避镉的毒性。这种逃避会显著影响肠道细菌在家禽体内的定殖和作物根中的植物相关细菌定殖。此外，农业的可持续发展将受到塑造生物抗逆性的影响。

本研究使用的试验土壤为人工土壤，是一种理想的仅含镉的胁迫环境。但考虑到实际污染环境的复杂性，尤其是Cd与抗生素的联合胁迫(畜牧业)，以及Cd与微塑料的联合胁迫(农业)，需要在此基础上进一步进行一系列的研究。

在镉胁迫下蚯蚓的解毒机制中，发现HBA、NEUROD1和ABCA3基因是蚯蚓微生物群落的调控基因。TC.FEV.OM基因和cheBR基因是土壤微生物群落的主要调控基因。同时，本研究证实了在第五调控阶段出现的耐镉微生物是Massilia的一个新的未命名种。此外在镉胁迫后，占据蚯蚓和土壤中微生物绝对丰度的物种都是未命名的新物种。

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