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1 在神经发育遗传缺陷的小鼠中，不同繁育方式影响其行为及肠道菌群

通过动物三箱社交自由探索实验来检测孤立繁殖体系所得的Cntnap2 ^-/-（KO-I）和 Cntnap2^+/+（WT-I）小鼠其社交能力及社交新奇偏好，如前人所报道，KO-I小鼠表现出明显的社交能力缺陷（图1C）及社交新奇偏好降低（图1D）。KO-I小鼠不愿与陌生小鼠交流并且也不会对新来的小鼠感到好奇。因此，在社交互动实验中，KO-I小鼠之间的相互交流也较WT-I小鼠更少（图1E）。通过寻找埋藏食物实验我们可以发现，KO-I小鼠嗅觉并无异常（Mann-Whitney U =66, P = 0.7444)，这证实该小鼠的社交缺陷并非嗅觉异常所致。此外，KO-I小鼠在自发活动中表现出多动症样的行为（图1F-G），这与其他研究是一致的。因此，我们证明孤立繁殖体系所得的Cntnap2 ^-/-小鼠存在显著的社交能力缺陷及多动症行为。

有研究报道自闭症病人存在肠道菌群结构的改变。因此我们通过16S rRNA测序分析了本组实验中小鼠的肠道菌群。PCA分析、PCoA分析（分别用Bray–Curtis差异矩阵和未加权UniFrac距离）分析都证实上述两组小鼠肠道菌群β多样性存在显著差异（图1H、图S1B及图S1C）。分析Shannon指数来评估其菌群的α多样性发现，KO-I小鼠肠道菌群丰度较WT-I小鼠更高（图S1D-E）。此外，33个扩增子序列变异（ASVs）及33个通过PICRUSt2预测的微生物代谢途径在两组见存在显著差异（图1I和图S1F-H）。因此，孤立繁殖体系所得的Cntnap2 ^-/-小鼠的肠道菌群与Cntnap2^+/+的存在显著差异。

图1 孤立繁殖体系所得的Cntnap2 ^-/-小鼠与其野生型相比存在社交能力缺陷、多动症及不同的肠道菌群结构。（A）孤立繁育体系（Cntnap2 ^-/-：KO-I；Cntnap2^+/+：WT-I）。（B）实验设计。（C-D）动物三箱社交自由探索实验（每组n = 17; C, 社交能力: WT-I: t = 7.508, P< 0.0001; KO-I:t = 1.01, P = 0.6322; 两因素方差分析: F_1,64= 21.11, P < 0.0001; D, 社交新奇偏好: WT-I: t = 6.386,P < 0.0001; KO-I: t = 0.2782, P > 0.9999; 两因素方差分析, F_1,64= 18.65, P < 0.0001）。（E）社交互动实验（每组n = 15–16, Mann-Whitney U = 52.50, P = 0.0065）。（F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测的自发活动程度（每组n = 17; (F), 总距离: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0002; (G), 平均速度: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0002）。（H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA: R² = 0.35732, P = 0.0002）。（I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs，绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方图为均值±标准误。

有学者认为只有使用同窝对照时所得的遗传突变表型差异证据才更为确凿，因此，我们通过Cntnap2 ^-/+杂交小鼠繁育所得的同窝出生的Cntnap2 ^-/-（KO-L）和 Cntnap2^+/+（WT-L）小鼠重复上述实验。不出意外，KO-L小鼠依然存在显著的多动症表现（图2F-G）。但是令人惊讶的是，KO-L小鼠的社交行为是正常的（图2C-E）。不论是α多样性还是β多样性，抑或是ASVs 或菌群代谢通路，KO-L小鼠肠道菌群结构与WT-L小鼠没有显著差异（图2H-I）。因此，同窝出生的Cntnap2 ^-/-小鼠与 Cntnap2^+/+小鼠比较存在多动症表型，但是其社交能力及肠道菌群无显著差异。

图2 同窝繁殖体系所得的Cntnap2 ^-/-小鼠与其野生型相比社交能力正常、肠道菌群结构相似，但仍然存在多动症表现。（A）同窝繁育体系（Cntnap2 ^-/-：KO-L；Cntnap2^+/+：WT-L）。（B）实验设计。（C-D）动物三箱社交自由探索实验（每组n = 14; C, 社交能力: WT-L: t = 5.856, P < 0.0001; KO-L: t = 7.849,P < 0.0001; 两因素方差分析: F_1,52= 1.938, P < 0.1650; D, 社交新奇偏好: WT-L: t = 2.415,P = 0.0386; KO-L: t = 3.145, P = 0.0055; 两因素方差分析, F_1,52= 0.266, P = 0.6082）。（E）社交互动实验（每组n = 16, Mann-Whitney U = 124, P = 0.897）。（F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测的自发活动程度（每组n = 14; (F), 总距离: WTL vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0091; (G), 平均速度: WT-L vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0095）。（H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA:R² =0.04440, P = 0.26975）。（I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs，绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方图为均值±标准误。

2 在神经发育遗传缺陷的小鼠中，肠道菌群选择性改变社交行为而非自发活动

使用同窝对照时所得的遗传突变表型差异可以说是研究遗传易感性表型的金标准，但是对于肠道菌群而言，同窝饲养本身就可能导致菌群改变从而掩盖了菌群对行为的影响。通过上述研究我们假设，社交行为表型是由肠道菌群导致而自发活动表型是由遗传因素（即Cntnap2敲除）所导致的。为了验证该假设，我们进行了下面三个实验。1）将KO-I小鼠和WT-I小鼠同笼饲养；2）将原来同笼饲养的WT-L和KO-L小鼠分笼饲养；3）将上述四组小鼠（KO-I，KO-L，WT-I，WT-L）的肠道微生物通过粪菌移植（FMT）的方法移植给无菌小鼠（GF）。

对于同笼饲养的KO-I小鼠和WT-I小鼠（图3A-B），他们的肠道菌群可以相互影响最终趋于一致。我们发现同笼饲养的KO-I小鼠和WT-I小鼠菌群结构相似，不存在显著不同的ASVs 或菌群代谢通路（图3I），组间α多样性（菌群丰度）和β多样性（PCA分析）差异（PERMANOVA R²= 0.11, P = 0.044）较孤立繁育的KO-I小鼠和WT-I小鼠组间的差异小（PERMANOVA R²= 0.36, P = 0.0002）。重要的是，同笼饲养的KO-I小鼠社交行为恢复正常（图3C-E）但是仍然存在多动症行为（图3F-G）。

将原来同笼饲养的WT-L和KO-L小鼠分笼饲养并繁育得到的下一代（WT-T和KO-T，图4A-B），我们发现KO-T小鼠虽然社交能力正常，但是社交新奇偏好显著降低（图4C-D），该指标与ASDs症状密切相关，因此我们认为KO-T 小鼠存在社交缺陷。此外，KO-T 小鼠较WT-T小鼠多动症行为更明显（图4F-G）。KO-T小鼠肠道菌群与WT-T存在显著差异（图4H-I），表现在他们间有73个差异ASVs和44个微生物代谢通路不同。因此，该实验证明分笼饲养负向调节了KO小鼠的社交行为并且改变其菌群结构，但是对于多动症行为没有显著影响。

最后，为了排除亲代饲养及其他变量对行为的影响，并且分析菌群改变对Cntnap2 ^-/-小鼠行为影响的因果关系，我们将WT-I、KO-I、WT-L、KO-I组小鼠的肠道菌群通过粪菌移植的方法移植给无菌（GF）小鼠（图5A）。同其他无菌动物粪菌移植试验一样，粪菌移植后各组的菌群很大程度上保持了所移植的菌群特征（图S3）。与其他研究一致，GF小鼠的行为学表现为社交能力缺陷和较高社交新奇偏好的特点。不同组粪菌移植后的GF小鼠与其所移植粪便来源的小鼠表现出几乎相同的行为。移植WT小鼠来源的粪便后（GF：WT-I，GF：WT-L），GF小鼠的社交能力缺陷均有所改善（图5B-C）。对于移植了KO小鼠来源粪便的GF，仅KO-L组粪菌移植的GF小鼠（GF：KO-L）社交障碍得到了改善，KO-I组粪菌移植GF小鼠（GF：KO-I）社交障碍依然存在（图5B-C）。因此，这些数据证实KO-I组小鼠可能缺少一些对于社交行为至关重要的一种或几种肠道细菌。因为FMT并没有改变移植后GF小鼠的多动症（图5D-E），所以本研究结果证明Cntnap2 ^-/-小鼠的社会缺陷是由微生物组的改变导致的。

图3 同笼饲养逆转了KO-I组小鼠的社交缺陷并且导致了相似的肠道菌群结构，但是并没有逆转多动症表现。（A-B）实验设计方案。（C-D）通过动物三箱社交自由探索实验检测同笼饲养的WI-I和KO-I小鼠的社交行为（每组n = 31-32; C, 社交能力: 同笼饲养的WT-I: t = 9.442, P < 0.0001; 同笼饲养的KO-I: t = 9.284, P < 0.0001; 两因素方差分析: F_1,122 = 0.04696, P =0.8288; D, 社交新奇偏好: 同笼饲养的WT-I: t = 3.666, P = 0.0007;同笼饲养的 KO-I: t = 3.066, P = 0.0053; 两因素方差分析, F_1,122= 0.2135, P = 0.6448）。（E）通过社交互动实验检测同笼饲养的WI-I和同笼饲养的KO-I小鼠的社交行为（每组n = 22, 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I, Mann-WhitneyU = 192, P = 0.2456）。（F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测笼饲养的WI-I和同笼饲养的KO-I小鼠的自发活动程度（每组n = 31-32; (F) 总距离: 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I: Mann-WhitneyU = 307, P = 0.0089; (G) 平均速度: 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I: Mann-WhitneyU = 303, P = 0.0074）。（H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA:R²=0.11351, P = 0.04459）。（I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs，绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方图为均值±标准误。也可参见图S2，表S1-2。

图4 同笼饲养逆转了KO-I组小鼠的社交缺陷并且导致了相似的肠道菌群结构，但是并没有逆转多动症表现。（A-B）实验设计方案。（C-D）通过动物三箱社交自由探索实验检测同笼饲养的WI-I和KO-I小鼠的社交行为（每组n = 31-32; C, 社交能力: 同笼饲养的WT-I: t = 9.442, P < 0.0001; 同笼饲养的KO-I: t = 9.284, P < 0.0001; 两因素方差分析: F_1,122 = 0.04696, P =0.8288; D, 社交新奇偏好: 同笼饲养的WT-I: t = 3.666, P = 0.0007;同笼饲养的 KO-I: t = 3.066, P = 0.0053; 两因素方差分析, F_1,122= 0.2135, P = 0.6448）。（E）通过社交互动实验检测同笼饲养的WI-I和同笼饲养的KO-I小鼠的社交行为（每组n = 22, 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I, Mann-WhitneyU = 192, P = 0.2456）。（F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测笼饲养的WI-I和同笼饲养的KO-I小鼠的自发活动程度（每组n = 31-32; (F), 总距离: 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I: Mann-WhitneyU = 307, P = 0.0089; (G), 平均速度: 同笼饲养的WI-I vs.同笼饲养的KO-I: Mann-WhitneyU = 303, P = 0.0074）。（H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA:R²=0.11351, P = 0.04459）。（I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs，绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方图为均值±标准误。也可参见图S2，表S1-2。

图5 粪菌移植实验（FMT）可以将供者的社会行为表型赋予受者而不是自发活动表型。（A）FMT实验的实验设计方案。（B-C）通过动物三箱社交自由探索实验检测FMT后GF小鼠的社会行为（每组n=9-21；B，社交能力：正常菌对照：t = 8.51，P < 0.0001；GF: t = 0.572，P > 0.9999；GF:WT-I FMT: t = 6.557，P < 0.0001；GF: KO-I FMT: t = 0.05714，P > 0.9999；GF: WT-L FMT: t = 5.673，P < 0.0001; GF: KO-LFMT: t = 6.485, P <0.0001；GF: KO-L FMT: t = 6.485，P < 0.0001；两因素方差分析: F_{5, 144}=16.61，P < 0.0001；C，社交新奇偏好：正常菌对照t = 3.82，P = 0.0012；GF: t = 0.1557，P > 0.9999；GF: WT-I FMT: t = 4.564，P < 0.0001；GF: KO-I FMT: t = 0.1194，P > 0.9999；GF: WT-L FMT: t = 4.006，P = 0.0006；GF: KO-L FMT: t = 5.73，P <0.0001；两因素方差分析: F_{5, 144} =7.100，P < 0.0001）。（D-E）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测FMT后各组GF小鼠的自发活动程度（每组n=10–22；D，总距离: 正常菌定植与无菌定植GF: t=2.494，P = 0.2230；GF: WT-I vs. GF: KO-I: t = 2.173，P = 0.4942； GF: WT-L vs. GF: KO-L: t = 0.3335，P > 0.9999；单因素方差分析：F_5,74 =2.529，P = 0.0361；平均速度：正常菌定植与无菌定植GF: t = 2.501，P = 0.2190；GF: WT-I vs.GF: KO-I: t = 2.218，P = 0.4448; GF: WT-Lvs. GF: KO-L: t = 0.3367，P > 0.9999；单因素方差分析：F_5,74 =2.559，P = 0.0343）。直方图为均值±标准误。也可参见图S3和表S1和S2。

3 选择性微生物干预可以改善神经发育遗传缺陷小鼠的社交能力缺陷，但是对多动症无效

虽然我们提供了Cntnap2 ^-/-小鼠的微生物组的特征，但我们的前期研究主要集中在其特定的脑回路上，尤其是催产素能系统。已知在已有的Cntnap2 ^-/-小鼠相关报道中，催产素系统调节社会行为的许多方面，并且与自闭症相关。下丘脑室旁核（PVN）是脑内主要合成催产素的区域，Cntnap2 ^-/-小鼠的室旁核催产素相关神经元较少，并且催产素治疗何以改善小鼠的社交缺陷。相应的我们的研究也发现催产素治疗可以逆转Cntnap2 ^-/-（KO-I）小鼠社交障碍而并未逆转多动症行为（图S4A-F）。

我们以及一些其他研究都发现罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri，L. reuteri）干预可以使血浆和PVN催产素水平升高，并且逆转一些ASDs模型小鼠的社交障碍。然而，同样的操作在缺乏催产素受体的小鼠上却无效。因此我们进一步猜测罗伊氏乳杆菌治疗可以改善Cntnap2 ^-/-小鼠社交障碍。首先，我们检测了罗伊氏乳杆菌在KO-I小鼠中是否改变，我们通过qPCR方法检测发现罗伊氏乳杆菌丰度在KO-I组中丰度降低（图S5A）。其次，我们发现罗伊氏乳杆菌治疗可以逆转KO-I小鼠催产素神经元的缺陷（图S4G-J）。第三点并且是最重要的是，我们发现罗伊氏乳杆菌治疗逆转了KO-I组幼年以及成年小鼠的社交缺陷（图6A-C，6G，图S5B-D）。第四点，相同的微生物干预并不影响KO-I组小鼠的多动症表现（图6D-E）。因此，对KO-I组小鼠进行早期或晚期的精确微生物干预可以选择性的逆转社交障碍，而非多动症表现。这一结论支持决定社交行为和自发活动的因素是不同的。

4 选择性微生物干预通过影响中脑腹侧被盖区的社交相关突出传递进而改善神经发育遗传缺陷小鼠的社交能力缺陷

包括中脑腹侧背盖区（VTA）的脑区是大脑内的奖励刺激应答区，亦是在社交行为调控中起重要作用的脑区。准确的说，PVN中表达催产素的神经元投射至VTA的多巴胺（DA）神经元，被催产素激活的DA神经元在社交活动中是至关重要的。通过检测α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPRA）和N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDRA）的比值，我们和其他研究发现社交活动激活了鸟类和小鼠VTA的DA神经元，这一点与“社交活动是一种特殊的奖励机制”的观点吻合。有趣的是，这种潜在的社交细胞相关性，即VTA-DA神经元中社交活动诱发的突触传递，在存在社交缺陷的ASD模型中也是受损的。罗伊氏乳杆菌治疗以催乳素依赖的方式逆转逆转不同ASD小鼠模型的突触缺陷。我们发现，与对照组小鼠相比，社交活动未能诱导KO-I组小鼠 VTA神经元AMPAR/NMDAR比值升高（图6F-H）。与之相反，可卡因给药导致VTA DA神经元的AMPAR/NMDAR比率增加，表明DA神经元功能正常并且对奖赏刺激存在反应，但对社会奖赏刺激没有反应（图6H），罗伊氏乳杆菌治疗改善了Cntnap2 ^-/-（KO-I）小鼠VTA DA神经元中社交互动诱导的突触可塑性缺陷（图6H），再次确定罗伊氏乳杆菌增强了社交刺激的有效性及奖励机制。

为了评估罗伊氏乳杆菌是否影响与社会行为有关的其他大脑区域的突触传递，我们检测了KO-I和WT-I小鼠的内侧前额叶皮质（mPFC）中的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）。与前人的结果一致，与WT-I小鼠相比，KO-I小鼠mPFC锥体细胞中mEPSCs的振幅和频率降低（图6I–6K）。罗伊氏乳杆菌治疗未能逆转KO-I小鼠中mEPSCs的变化（图6I–6K）。这些数据表明，罗伊氏乳杆菌在VTA中选择性地调节突触传递的变化，而在mPFC中没有。

综上所述，使用罗伊氏乳杆菌干预可挽救KO-I小鼠的社会行为以及与社会行为相关的可塑性缺陷，但不能挽救多动症表型。

图6 罗伊氏乳杆菌干预不改变Cntnap2 ^-/-小鼠自发活动水平，却能改善其社交缺陷和突触传递相关变化（A）罗伊氏乳杆菌治疗的实验设计方案。（B-C）在动物三箱社交自由探索实验中评估的罗伊氏乳杆菌治疗小鼠的社会行为（每组n=19-22；B，社交能力：WT-I +无菌基质： t = 5.329，P < 0.0001；KO-I +无菌基质：t = 0.2167，P > 0.9999；KO-I + 罗伊氏乳杆菌：t = 12.75，P < 0.0001；两因素方差分析：F_2,116 =36.34，P < 0.0001；C，社交新奇偏好：WT-I +无菌基质：t = 6.228，P < 0.0001；KO-I +无菌基质：t = 1.241，P = 0.6516；KO-I + 罗伊氏乳杆菌：t = 6.934，P < 0.0001；两因素方差分析，F_2,116 =20.02，P < 0.0001）。（D-E）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段评估的罗伊氏乳杆菌治疗小鼠的自发活动水平（每组n=19–22；D，总距离：WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 4.143，P = 0.0003；WT-I +无菌基质vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 3.935，P = 0.0007；KO-I +无菌基质 vs. KO-I +罗伊氏乳杆菌: t = 0.3565，P > 0.9999；单因素方差分析，F_2,58 =10.86，P < 0.0001；E，平均速度：WT +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 3.646，P = 0.0017；WT +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 3.072，P = 0.0097；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 0.6995，P > 0.9999；单因素方差分析，F_2,58 =7.663，P = 0.0011）。（F）电生理实验设计方案。（G）社交互动试验中评估了罗伊氏乳杆菌治疗小鼠的社会行为（每组n=16–28对，WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 6.490，P < 0.0001；WT-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌：t = 1.079，P = 0.8552；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌：t = 7.707，P < 0.0001；单因素方差分析，F_2,57 =37.53，P < 0.0001）。（H）在基线水平和社交互动后24小时记录的VTA的DA神经元的AMPAR和NMDAR电流（上图）和AMPAR/NMDAR比值（下图）（每组n=6-14；WT-I+无菌基质组基线水平vs. 社交活动后：t = 3.462，P = 0.0203；KO-I+无菌基质的基线水vs. 社交活动后：t = 0.4072，P > 0.9999；基线水平的WT-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌：t = 0.1927，P > 0.9999；KO-I +无菌基质基线水平vs. KO-I +无菌基质+可卡因：t = 3.773，P = 0.0075；KO-I + 罗伊氏乳杆的菌基线水平vs. 社交活动后：t = 3.467，P = 0.0201；单因素方差分析，F_6,63 =7.119，P < 0.0001）。（I）微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的代表性痕迹。（J） mEPSCs波幅（每组n=7-9；WT-I+无菌基质vs. KO-I+无菌基质：t = 3.884，P = 0.0026；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 1.295，P = 0.6278；WT-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 2.385，P = 0.0797；单因素方差分析：F_2,21 =7.680，P = 0.0031）在用罗伊氏乳杆菌治疗的WT-I、KO-I和KO-I组中。（K） mEPSCs频率（每组n=7-9；WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 3.802，P = 0.0031；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 0.9573，P > 0.9999；WT-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 2.637，P = 0.0462；单因素方差分析：F_2,21 =7.597，P = 0.0033）在用罗伊氏乳杆菌治疗的WT-I、KO-I和KO-I组中。直方图为均值±标准误。也可参见图S4和S5。

5 微生物产生的特定代谢物能逆转神经发育遗传缺陷小鼠社交能力和突触的缺陷，但是无法逆转多动症行为

肠道微生物产生的或诱导产生的代谢物可在胃肠道以外传递信号，并通过脑肠轴调节大脑功能。为了研究罗伊氏乳杆菌改善KO-I小鼠社会缺陷的机制，我们进行了非特异性肠道代谢组学分析。无监督层次聚类分析显示，KO-I小鼠的代谢谱与WT-I小鼠的代谢谱明显不同（图7A），并且罗伊氏乳杆菌治疗不会将KO-I小鼠的整体代谢谱移回到WT-I的状态（图7A）。鉴于此，我们接下来想知道是否有特异性代谢物的变化可以帮助区分社交正常（WT-I，KO-I+罗伊氏乳杆菌）和社交缺陷小鼠（KO-I）。随机森林分析显示，在社交正常和缺陷小鼠之间，最具差异性的两种代谢物是生物喋呤和二氢生物喋呤（BH2），这是四氢生物喋呤（BH4）代谢途径中的两种代谢物（图7B）。更重要的是，与WT-I相比，KO-I小鼠中这些代谢物的水平显著降低，并通过罗伊氏乳杆菌治疗得到完全改善（图7C和7D）。

BH4是一种具有生物活性的生物蝶呤分子，是许多重要酶的辅酶，这些酶产生多巴胺、血清素和一氧化氮等神经活性分子。罗伊氏乳杆菌上调BH4途径中代谢物的水平（图7C和7D）并改善KO-I小鼠的社交缺陷，但不能改善其多动症表型（图6B–6E和6G），与此同时，因为KO-I小鼠的社交缺陷由微生物组介导（图1、2、3、4和5；图S1、2和3），所以我们想知道单独用BH4干预是否可以选择性地逆转KO-I小鼠的社交缺陷。为了回答这个问题，KO-I小鼠经口灌胃给予BH4（或溶剂）治疗（图7E）。结果值得我们关注，与罗伊氏乳杆菌治疗一样，单独使用BH4治疗可改善VTA脑区DA神经元导致的社交缺陷（图7F、G和I）和受损的社交奖赏相关突触可塑性（图7H和7J）。相反，BH4治疗未能改善KO-I小鼠的多动症表型（图7K - L）。上述结论进一步证实了社交缺陷由微生物组的变化介导，而多动症表型由宿主基因调节的观点。因此，罗伊氏乳杆菌通过调节宿主肠道内内源性四氢生物蝶呤水平，至少部分逆转了社交能力和突触可塑性缺陷。

为了检验BH4是否直接影响社交行为，或通过改变微生物组对社交行为产生影响，我们接下来检验了BH4是否能够改善GF小鼠的社会缺陷（图S6A）。与先前的研究结果一致，我们也发现定植罗伊氏乳杆菌改善GF小鼠的社交缺陷，此外，我们还发现BH4也能逆转GF小鼠的社交缺陷（图S6B和S6C）。正如我们所料，BH4对GF小鼠的自发活动水平没有影响（图S6D和S6E）。这些发现提供了另一个证据，即Cntnap2 ^-/-小鼠的社会行为表型是由肠道微生物组介导的，而多动症表型是由宿主遗传决定的。在证明了BH4对于社会行为是由足够影响之后，我们接下来探索了罗氏乳酸菌对社会行为的影响是否依赖于生物蝶呤途径。为了回答这个问题，用罗伊氏乳杆菌治疗的Cntnap2 ^-/-（KO-I）小鼠被注射SPRi3（图S7A），SPRi3是一种有效且选择性的乌贼蛋白还原酶抑制剂，是BH4合成途径中最后一个关键酶。有趣的是，当BH4合成在药理学上被阻断时，罗伊氏乳杆菌未能改善KO-I小鼠的社交缺陷（图S7B–S7D），这表明罗伊氏乳杆菌通过调节宿主的BH4系统来改善社交缺陷。值得注意的是，SPRi3不影响经罗伊氏乳杆菌治疗的KO-I小鼠的自发活动能力（图S7E和S7F），这进一步证实了社交缺陷和多动症表型有不同起源的观点。最后，我们检查了BH4是否是WT小鼠正常社会行为所必需的（图S7G）。我们发现SPRi3对BH4合成的药理学抑制会损害WT小鼠的社会行为（图S7H–S7J），但不会显著改变运动活动（图S7K和S7L）。因此，BH4系统是有选择地需要正常的社会行为。

图7 罗伊氏乳杆菌选择性地上调来自四氢生物蝶呤（BH4）合成途径的代谢物，BH4改善Cntnap2 ^-/-小鼠的社会缺陷，而不是自发活动水平（A）WT-I+无菌基质、KO-I+无菌基质和KO-I+罗伊氏乳杆菌组的小鼠粪便代谢物的层次聚类分析热图（每组5-6只）。选择推理值（SI）（蓝色）表示树中每个边（灰色）的稳定性。（B）通过随机森林分类法分析WT-I+无菌基质和KO-I+罗伊氏乳杆菌与KO-I+无菌基质（每组n=5-6）之间差异最显著的30种粪便代谢物。（C-D）BH4合成途径中的代谢物水平（每组n=5–6；（C）生物蝶呤：WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质： t = 7.159，P < 0.0001；WT-I + 无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 0.6152，P > 0.9999；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + 罗伊氏乳杆菌: t = 6.211，P < 0.0001；单因素方差分析，F_2,14 =30.69，P < 0.0001；D，二氢生物蝶呤：WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 10.34，P < 0.0001；WT-I + 无菌基质 vs. KO-I +罗伊氏乳杆菌: t = 1.006，P = 0.9944；KO-I +无菌基质 vs. KO-I +罗伊氏乳杆菌: t = 8.852，P < 0.0001；单因素方差分析，F_2,14 =63.40，P < 0.0001）。（E） BH4处理的实验设计方案。（F-G）在动物三箱社交自由探索实验中评估的BH4处理的小鼠社会行为（每组n=13–14；F，社交能力：WT-I +无菌基质： t = 6.488，P < 0.0001；KO-I +无菌基质：t = 1.968，P = 0.1581；KO-I + BH4: t = 5.514，P < 0.0001；两因素方差分析： F_2,76 = 5.205，P = 0.0076；G，社交新奇偏好：WT-I +无菌基质：t = 6.395，P < 0.0001；KO-I +无菌基质：t = 1.930，P = 0.1722；KO-I + BH4: t = 6.611，P < 0.0001；两因素方差分析，F_2,76 =6.434，P = 0.0026）。（H）电生理实验设计方案。（I）社交互动试验检测BH4处理小鼠的社会行为（每组n = 9–10对， KO-I +无菌基质 vs. KO-I + BH4: Mann-Whitney U = 9，P = 0.0021）。（J）在基线水平和社交互动后24小时记录的VTA 的DA神经元AMPAR和NMDAR电流（上图）和AMPAR/NMDAR比值（下图）（每组n=6–8；KO-I +无菌基质基线水平 vs. 社交互动后：t = 0.9717，P > 0.9999；基线水平下KO-I +无菌基质 vs. KO-I+BH4：t = 0.2975，P > 0.9999；KO-I +无菌基质社交互动后 vs. KO-I + BH4基线水平：t = 0.7109， P> 0.9999； KO-I + BH4基线水平 vs. KO-I + BH4社交互动后：t = 4.322，P = 0.0015；单因素方差分析，F_3,23 =9.125，P = 0.0004）。（K-L）在动物三箱社交自由探索实验的习惯化阶段评估的BH4处理小鼠的自发活动水平（每组n=13–14；K，总距离：WT-I +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质：t = 4.763，P < 0.0001；WT-I +无菌基质 vs. KO-I + BH4：t = 6.833，P < 0.0001；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + BH4：t = 1.943，P = 0.1784；单因素方差分析，F_2,38 =24.66，P < 0.0001；L，平均速度：WT +无菌基质 vs. KO-I +无菌基质: t = 4.827，P < 0.0001；WT +无菌基质 vs. KO-I + BH4: t =6.853，P < 0.0001；KO-I +无菌基质 vs. KO-I + BH4: t = 1.898，P = 0.1961；单因素方差分析，F_2,38 =24.90，P < 0.0001）。直方图为均值±标准误。也可参见图S6和S7。

我们知道个体生理学和行为学的许多方面都会受到宿主基因组和微生物组的极大影响。迄今为止，人们都单独的关注宿主基因或微生物基因对小鼠行为表型的影响。鉴于我们不仅受自身基因影响，而且受微生物及其相互作用的影响，因此了解特定神经系统疾病的症状是由宿主基因变异对脑功能的直接影响引起的，还是由宿主脑-肠-菌轴的改变引起的，这一点至关重要。我们发现不同的适应不良行为有着不同的病因。具体地说，使用7种独立的方法（同笼饲养法、分离实验、粪菌移植到GF小鼠、选择性罗伊氏乳杆菌干预、选择性BH4治疗、催产素治疗和SPRi3治疗）以及微生物组基因和扩增子测序分析，我们提供了支持同样结论的证据，即在神经发育障碍基因的小鼠模型中，社会行为表型由肠道微生物组决定，而动物的自发活动水平则由宿主等位基因直接调节。

我们还发现，罗伊氏乳杆菌干预不同发育阶段的Cntnap2 ^-/-小鼠都能够选择性地改善其社交缺陷，这表明微生物恢复社会行为的时间窗很宽。此外，利用非特异性代谢组学分析，我们还证明罗伊氏乳杆菌能促进宿主内源性BH4合成途径，并且证明了在不进行任何微生物干预下，将BH4直接给药到动物肠道后也能改善小鼠社会行为和突触功能的缺陷，但是对自发活动水平没有任何影响。在今后的实验中，确定其他产生或诱导BH4产生的细菌种类并检验它们是否能够促进社会行为将是一件有趣的事情。

此前，我们已经证明，罗伊氏乳杆菌通过迷走神经和催产素系统向大脑发送信号并调节社会行为。更具体地说，手术切断迷走神经或抑制DA神经元中的催产素受体，都会阻止罗伊氏乳杆菌介导的亲社会效应。有趣的是，BH4已被证明能增加大鼠体内的催产素释放，而我们发现与无菌基质处理的KO-I小鼠相比，BH4不能改善用选择性催产素受体拮抗剂处理的KO-I小鼠的社交缺陷（图S6F和6G）。今后的实验将检验BH4的特异性作用以及其作用是否由迷走神经介导。最后我们认为，BH4的发现特别有趣：因为在对人类的研究中表明，BH4治疗可以改善自闭症患者的一些临床症状，包括社会行为相关症状。

此外，我们的发现也表明，在行为神经科学中对行为的研究时考虑到微生物的作用是极其重要的。毫无疑问，控制基因组和微生物变量的一致应该匹配对照的金标准。然而，正如我们在研究Cntnap2 ^-/-小鼠的社会行为中发现的那样：如果微生物群是一个作用因素，一些表型可以由于共同居住条件而被掩盖。事实上，这些发现提出了一种有趣的可能性，即在疾病的其他遗传模型（如糖尿病、癌症、免疫、病毒感染、神经系统疾病）中看到的表型可以由宿主基因、微生物组的变化和/或它们的相互作用导致。因此，在未来的实验中，有必要考虑到全基因组的复杂性，以便充分了解不同行为的病因。考虑到以前未考虑的变量，如肠道微生物组成、实验动物繁育方案和宿主微生物群的相互作用，今后的研究不仅应提高结果的可重复性，还应提高该研究的价值及其在神经系统疾病不同动物模型治疗中的潜力。

最后，鉴于目前遗传神经疾病发病以大脑为中心的研究观点，我们相信我们的研究结果拓宽了我们对基因突变如何导致行为异常的理解。此外，这些证据也证明，靶向针对与大脑和肠道微生物进行干预，可充分有效地逆转与某些神经系统疾病相关的核心症状。

我们的研究表明遗传性脑疾病的特定症状（或行为异常）可能是通过宿主基因和微生物群的共同作用而产生的。为了充分了解这一现象背后的机制，还需要开展更多的工作。这些研究包括：（1）研究Cntnap2 ^-/-的丢失如何导致肠道微生物群组成的改变；（2）BH4产生和向大脑发送信号的确切机制。明确我们的发现是否具有普遍性以及是否可以扩展到其他复杂行为和/或疾病也将是一个有趣的问题。例如，其他基因突变是否通过宿主基因和微生物组相互作用来调节行为和大脑功能？其他疾病，如肥胖症、癌症、代谢紊乱和免疫力是否也受宿主基因和肠道微生物群的控制？如果是这样的话，我们能利用这些知识开发基于新的微生物疗法的针对特定遗传疾病的精确药物吗？

自菌-肠-脑轴的不断深入研究，许多研究者发现很多过去认为主要由遗传因素引起的疾病中，肠道微生物也起着重要的作用。肠道微生物可以参与调控宿主炎症水平、行为等多方面。但是肠道微生物和宿主遗传易感性在对宿主调控中分别起了什么样的作用，以及他们二者间是否存在潜在的复杂相互作用，这都是尚不明晰的。美国贝勒医学院神经科学系的MauroCosta-Mattioli团队发表的这篇研究利用Cntnap2敲除小鼠这一典型的遗传突变所致社交行为学异常的模型，通过研究其肠道微生物组改变，层层递进的揭示了遗传易感性决定Cntnap2敲除小鼠多动症表型，而肠道微生物通过罗伊氏乳杆菌街道BH4代谢通路以及催产素依赖的调节了Cntnap2敲除小鼠的社交行为。该研究可以说是研究遗传因素与肠道微生物因素在宿主行为调节机制中具有里程碑意义的发现。

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