原名：Gut microbiota determines the social behavior of mice and induces metabolic and inflammatory changes in their adipose tissue

译名：肠道微生物群决定小鼠的社会行为并诱导其脂肪组织的代谢和炎症变化

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：7.067

发表时间：2021.3.19

通讯作者：Albert Pinhasov & Shiri Navon-Venezia

通讯作者单位：以色列阿里尔大学米里亚姆博士和谢尔顿·G·阿德尔森医学院 & 自然科学学院分子生物学系

本研究中使用的Dom和Sub小鼠是根据其在DSR试验中的行为选择性培育的。采用TCST（三室社交测验）来评估粪便微生物群移植GF雄性小鼠与陌生小鼠进行社交互动的动机，强迫游泳试验评估抑郁行为。从20只10周龄的Sabra和Sub小鼠和17只雄性GF移植小鼠收集粪便样本，采用16S扩增子测序检测V4（515F-806R）区，使用QIIME2对FASTQ数据进行处理和分析。分别进行α多样性和β多样性分析以及主成分分析（PCA）、聚类热图分析、LEfSe分析。在此基础上进行了小鼠体重随访、食物摄入量测量和脂肪组织去除检测、粪便移植实验以及基因表达定量，所有统计分析均使用GraphPad Prism 6进行。

1 Dom和Sub小鼠表现出不同的社会行为模式和体重

Sub小鼠的社交行为比Dom小鼠更为顺从，与性别无关（图1b，c），从DSR测试的第二天开始就可以观察到这些差异。这是一种在一对老鼠之间进行的社会性食物竞争行为测试，它们在一夜禁食后被放在同一个仪器中。在连续4天内测量每只小鼠的饮水持续时间，持续5分钟。在这项测试中，与同类老鼠相比，饮用时间更长的老鼠被定义为“支配老鼠”（Dom），其配对老鼠被定义为“顺从老鼠”（Sub）。本研究使用了选择性繁殖的支配和顺从小鼠的F24–F26代后代。如图1所示，两个行为组之间建立了明确的Dom-Sub关系（以饮用时间表示）。从2周龄到8周龄，所有小鼠的体重不断增加，但在整个生长期，Dom小鼠的平均体重显著（1.15倍）高于Sub小鼠（图1d，e，p < 0.001）。尽管在每个行为组中雄性的体重都明显大于雌性，但是Dom和Sub小鼠之间的体重差异是性别无关的（图1d，e）。Dom和Sub小鼠的食物摄入量相似（p> 0.05；图1f），表明观察到的体重差异不是由于摄食行为的差异所致。

图1 a 实验时间线。b、c Dom和Sub雄性（b）和雌性（c）小鼠的支配-顺从关系（DSR）试验结果（每组n = 10）。d、e Dom和Sub雄性（d）和雌性（e）小鼠的体重监测。f Dom和Sub小鼠（雄性和雌性合二为一）的食物摄入量与体重跟踪平行测定。

2 Sub小鼠含有较低的eWAT质量和较小的脂肪细胞

Sub小鼠的eWAT含量比Dom小鼠低1.5倍（图2a，p < 0.01）。组织学分析显示，Dom（图2b）和Sub（图2c）小鼠之间eWAT形态存在明显差异，定量分析显示，脂肪细胞大小显著降低1.25倍（p <0.05，图2d），Sub小鼠体内细胞大小异质性高。苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化染色显示，F4/80在Sub小鼠的eWAT中呈冠状结构，这是典型的巨噬细胞浸润。事实上，与Dom小鼠相比，Sub小鼠的eWAT显示巨噬细胞浸润增加了2.1倍（图2e–g，p <0.001）和F4 / 80基因表达增加了1.6倍（图2h，p <0.05）。

图2 a eWAT量化值。b、c 从Dom（b）和Sub（c）小鼠移除的eWAT的组织学染色的显微可视化。d Dom和Sub小鼠脂肪细胞直径的定量。e-g Dom (e)和Sub (f)小鼠(各10只)的F4/80巨噬细胞浸润通过免疫组化(40倍放大)评估，并使用ImageJ软件从组织学图像中定量（g）。从每只小鼠的10个随机场中，每个场分析10个随机细胞。f 中的箭头表示脂肪细胞之间巨噬细胞的冠状结构。h 巨噬细胞定量使用F4/80 mRNA基因表达，归一化HPRT，显示亚小鼠巨噬细胞表达增加。

3 Sub小鼠的eWAT表现出较高的脂肪因子水平

为了进一步探索Dom和Sub小鼠之间的差异，我们分析了eWAT脂肪因子的分布（图3）。对比分析显示，与Dom小鼠相比，Sub小鼠中38种与脂肪形成、代谢稳态和炎症有关的脂肪因子中，有18种的水平显著升高（p <0.05；图3b）。相比之下，与Sub小鼠相比，Dom小鼠中仅一种脂肪酶C反应蛋白显著升高。Sub小鼠还显示出解偶联蛋白1（UCP-1）的基因表达显著增加，该蛋白是脂肪组织产热和褐变的公认标志，表明Dom和Sub小鼠之间的能量消耗存在差异（图3c）。

图3 a 使用脂肪因子阵列比较从Dom或SubeWAT标本中提取的蛋白质。b 每个复制品标准化为阳性对照。c UCP-1（褐变标记物）mRNA基因表达在Sub组高于Dom组（每组n = 5）。

4 Sub和Dom小鼠具有不同的肠道微生物群组成

与Dom小鼠相比，Sub组小鼠的体重和eWAT质量明显降低，这使我们推测两组的肠道微生物组组成不同，进而可能改变了它们的能量稳态和炎症水平。为了验证这一假设，我们进行了16S rRNA测序测序以确定Dom、Sub和亲本菌株（BS）的肠道微生物群组成。该分析揭示了Dom和Sub小鼠之间在分类学组成上的显著差异，因此表现出相同行为表型的单个小鼠也表现出了相似的肠道菌群组成（图4c）。具体而言，Sub小鼠的肠道微生物组组成与Dom和BS小鼠不同，并且差异较小。以未加权的β多样性衡量BS，Dom和Sub小鼠的微生物系统相似性程度，两组之间存在显着差异。QIIME2中生成的其他α和β多样性度量提供了相似的结果（在补充图1和2中）。

Dom小鼠和Sub小鼠肠道菌群的另一个显著差异是各组的相对细菌丰度。效应大小（LEfSe）的线性判别分析（LDA）表明，Sub小鼠的肠道微生物组表现出较高的支原体科、门氏菌厌氧菌属、核仁科和梭菌科，显著高于Dom小鼠和BS小鼠。然而，在科水平上，Dom和BS小鼠肠道微生物中副真小叶藻科的菌比Sub小鼠含量显著较高（图4d，g，h）。

图4 a Dom、Sub和背景品系（BS）小鼠肠道微生物组的α多样性。b 主成分分析显示具有相同社会行为表型的小鼠肠道微生物群的聚集。c 确定的100个最变异物种的热图。d 相对丰度达到属水平,不同小鼠组肠道微生物群的分支图。e Dom和Sub小鼠分别被染成红色和绿色。f LEfSe发现Dom小鼠和Sub小鼠的LDA评分有显著差异。g LEfSe检测的支原体科（g）和副革兰氏菌科（h）生物标志物的 h 丰度直方图。

5 Sub小鼠的FMT赋予GF小鼠Sub行为模式和Sub eWAT特征

为了阐明肠道微生物组对行为以及代谢和炎症状况的影响，我们进行了从Dom和Sub小鼠到Swiss WebsterGF小鼠的FMT实验。首先，我们确认在GF移植小鼠中建立了Dom或Sub衍生的细菌群落。为此，我们在FMT后7天收集了从Dom移植的GF小鼠（GF Dom）、Sub移植的GF小鼠（GF / Sub）以及从Dom或Sub供体的粪便样品，进行16S rRNA高通量测序。结果显示，GF / Dom和GF/Sub小鼠之间的α多样性没有差异。每组中所有移植的GF小鼠的肠道微生物组的组成都相似，并且类似于供体小鼠的组成（图5b，c）。QIIME2中生成的其他α和β多样性分析提供了相似的结果（补充图1和2）。GF / Sub小鼠获得了Sub小鼠微生物群的一个证据是支原体属和Rikenellaceae科的菌丰度显著增加（图5d–f），通过LEfSe分析将其鉴定为Sub小鼠肠道微生物组生物标记（图4g）。

图5 a 实验时间表。b 在FMT后第7天对GF/Con、GF/Dom和GF/Sub小鼠的肠道微生物群主成分分析（n = 17）。c 物种水平上样品微生物组成的热图。d 相对丰度达到属水平。e 不同小鼠组肠道菌群的LEfSe支链图。不同类群间分布差异显著(p <0.05)。f 支原体科标记物在亚小鼠中的丰度直方图，以GF/Sub小鼠标记物LEfSe检测。每个条形图表示在单个鼠标中特定分类群的相对丰度。采用Bonferroni校正的单因素方差分析(one-way ANOVA)评估统计学意义。

接种后55天，GF小鼠中的单一亚衍生FMT导致所有移植的GF小鼠体重增加，而GF/Dom小鼠比GF/Sub小鼠体重增加（图6a）。此外，移植后4周观察到FMT导致了明显的行为改变。具体而言，GF / Sub小鼠采用了其供体Sub小鼠的顺从行为特征，即在三室社交测试（TCST）中测得的反社会行为和在强迫游泳测试（FST）中反映出的抑郁行为。在TCST中，GF / Sub小鼠的进入频率与空房间和陌生小鼠的房间相似（图6b，p = 0.0157），并且这些变化不是由速度或运动障碍的改变引起的。相反，GF/Dom小鼠明显更喜欢与陌生小鼠一起进入房间（图6c，d）。在FST中，与GF/Dom小鼠相比，GF / Sub小鼠的固定时间增加（p = 0.0068）（图6e）。对所有移植的GF小鼠进行了额外的行为测试，例如高架迷宫和开放视野，两组之间没有明显差异；例如，在DSR测试中，GF/Dom和GF/Sub小鼠的最后一天结果分别为26和60 s（p> 0.05；补充图3）。

观察到的行为变化与脂肪组织质量、细胞大小和脂肪因子谱的变化显著相关。GF/Sub小鼠的eWAT质量（标准化为小鼠体重）明显低于GF/Dom小鼠（图6g），并且GF/Sub和GF/Dom小鼠的脂肪因子谱与其各自供体小鼠相似（图6i，j）。

图6 a 移植GF小鼠的体重随访。b 在TCST中测量b-d小鼠的社交行为。c 各组的平均速度（c）和距离（d）表现出相似的运动活动。d 与GF/Dom小鼠的正常行为相比，GF/Sub小鼠的抑郁样行为表现为FST中的静止时间。e 不同小鼠组肠道微生物的支链图。f 从GF小鼠获得的eWAT质量的量化，标准化为每只小鼠的各自体重。g GF移植小鼠的eWAT组织学（H&E）染色。h 用ImageJ软件测定移植GF小鼠的eWAT细胞直径。i 从GF/Sub (n = 4)和GF/Dom (n = 4)的eWAT中提取的聚类蛋白进行脂肪因子阵列比较。j FMT后eWAT脂肪因子的表达明显改变。每个条形图代表与阳性对照归一化后的重复脂肪因子表达的平均值。

我们的研究表明，成年小鼠具有密切相关的遗传背景，但表现出明显的支配或顺从的社会特征的成年小鼠具有不同的肠道微生物群组成，这与它们的行为特征相对应。每个小鼠亚群的独特的肠道微生物组可以解释Dom和Sub小鼠之间的体重差异，该差异从2周龄开始观察到，并持续到整个成熟期。Sub小鼠微生物群对GF小鼠的FMT导致了显著的行为改变，包括社交技能的损伤和抑郁样症状的增加，这是Sub小鼠行为的典型特征。这些小鼠的生理变化包括eWAT量减少，脂肪细胞更小和炎性轮廓改变-采用了Sub小鼠的主要eWAT特征。总的来说，我们得出结论，Sub小鼠微生物组移植的GF小鼠获得了Sub小鼠的主要行为和生理特征。

肠道菌群分析指出，Dom小鼠肠道菌群与BS小鼠肠道菌群相对相似，而Sub小鼠肠道菌群独特，其α多样性降低，并且具有 Mycoplasmaceae，Rikenellaceae和Clostridiaceae的特定细菌科，缺乏Paraprevotellaceae，该细菌只在Dom和BS小鼠中出现。必须强调的是，与我们的研究结果类似，在社交失败后的C57BL/6J小鼠和暴露于慢性轻度应激的小鼠中也观察到肠道微生物组丰富度和多样性降低。在人类中，精神疾病患者的肠道菌群多样性较低，包括抑郁症和焦虑症。值得注意的是，在人类中，从属行为被认为是抑郁症发病机制中的一个重要因素，因此我们在Sub小鼠肠道菌群中观察到的低细菌多样性与在患有严重抑郁症（MDD）的人类中观察到的一致。

这项研究中的一个重要发现是，在肠道微生物群中，特异性细菌属（支原体科和厌氧菌科）的支原体和厌氧菌质的独特存在，以及这些菌属与顺从行为之间的联系。这些结果与先前的研究结果不一致，之前的研究报告称，慢性社交失败后，应激敏感的C57BL/6小鼠体内的细线虫数量减少，这项研究报告了大鼠体内更高含量的Tenericutes，这表明在给大鼠提供高脂肪高糖食物后，它们的社会交往增加了。

我们在对压力敏感的Sub小鼠中发现的另一个独特的生物标记是细菌科Rikenellaceae，在其他小鼠研究中已报道该细菌与压力和eWAT炎症相关。例如，据报道该细菌家族在暴露于连续黑暗应激12周的C57BL/6J雄性小鼠中丰富，在成年B6129SF2 / J小鼠中也很丰富，这些小鼠出生于高脂肪饮食的母鼠，患有记忆力和探索性行为功能障碍。我们在文献中没有发现梭状芽胞杆菌与行为异常之间的相关性。Sub小鼠微生物群中Paraprevotella和Prevotella菌属的丰度降低也可能与这些小鼠对应激的脆弱性有关。在暴露于慢性轻度社交衰竭压力的小鼠中描述了类似的发现，而在对患有MDD47的患者的研究中也发现了Prevotella菌丰度的降低。

FMT实验支持肠道微生物群参与行为模式的形成，在FMT实验中，GF小鼠在单次移植后采用Sub小鼠的行为模式，包括社交（TCST）和抑郁（FST）行为。有趣的是，当我们在DSR试验中测试GF/Dom与GF/Sub小鼠时，移植的GF小鼠没有显示出明显的DSR模式。这一发现可以解释为，我们只进行了一次移植，也许额外的粪便移植会对DSR范式产生更显著的影响。此外，虽然与Dom小鼠相比，Sub小鼠具有较低的α多样性，但在GF/Dom和GF/Sub中观察到的移植GF小鼠的ASV没有显著差异。我们可以通过以下事实来解释这一点：FMT是用一池粪便（从四只具有相应行为表型的老鼠身上收集）进行的，而不是用单个老鼠的粪便，或者由于暴露在有氧条件下，这可能会影响一些细菌的生存能力。此外，我们只进行了一次FMT，可以合理地预期，因此可以合理预期其他移植会增加小鼠之间的显著差异。而且，尽管我们期望在GF/Sub小鼠肠道微生物组中发现较低的多样性，但这些小鼠获得了Sub肠道微生物组模式。

相当重要的一点，随着Sub行为模式的获得，移植伴随着Sub eWAT代谢和炎症特征的适应。目前只能推测eWAT代谢和炎症是否直接影响社会行为方式，以及如何直接影响社会行为方式。之前已经讨论了eWAT代谢和炎症脂肪因子对大脑健康的重要性，慢性社交失败应激的C57BL/6J小鼠表现出PPARγ的表达降低，PPARγ是控制脂肪因子基因表达的关键转录因子，表明eWAT生理学、社交互动和抑郁之间存在相关性。肥胖期间过度的脂肪扩张会导致脂肪组织功能障碍和促炎因子增加，从而导致全身性炎症。在另一项研究中，NLRP3炎症小体敲除小鼠在慢性应激后表现出抑郁行为减少，同时增加了普氏菌水平，从而将炎症，病理学行为和微生物组组成联系起来。

众多人体研究集中于炎症与MDD52之间的关系。确实，炎症和炎性细胞因子的释放已显示会影响患有MDD患者的大脑回路，从而导致他们的行为改变。在另一项与脂肪炎症和抑郁症相关的研究中，抑郁症状显示出促进体重积累的作用，从而促进了IL-6和Leptin54的炎症反应。相反，虽然Sub小鼠表现出类似抑郁的行为，并且eWAT代谢和炎性标志物明显升高，但它们的微生物组却促进了瘦型而不是肥胖型的表型。瘦型的Sub小鼠的表型与一项研究相吻合，该研究描述了在非肥胖而非肥胖患者中，情绪障碍与与脂肪组织炎症相关的基因的高表达之间的关联。

与Dom和GF/Dom小鼠相比，Sub和GF/Sub小鼠中的许多脂肪因子均明显上调。在成纤维细胞生长因子（FGF-21）和血管内皮生长因子（VEGF）中观察到最明显的差异。FGF21是脂肪细胞褐变的关键调节剂，通过调节UCP-1表达起作用，这与我们在Sub小鼠中观察到的较高的UCP-1 mRNA表达有关。VEGF对于脂肪巨噬细胞浸润至关重要，其作用是由VEGFR-3介导的，VEGFR-3在促炎性M1极化的巨噬细胞上被上调。因此，Sub和FMT-GF/Sub小鼠中这些脂肪因子的诱导进一步支持了我们的推测，即脂肪炎症是由肠道菌群衍生的因子触发的。

总之，我们的研究提供了对社交互动异常的新见解，并揭示了遗传性应激脆弱性，肠道微生物组组成，行为模式以及脂肪组织代谢和炎症之间的直接联系。Sub小鼠的微生物群进入GF小鼠的单次FMT导致体重减轻，并且与eWAT量的显著降低相关，并伴随着诱发的炎症和代谢改变。Sub粪便移植的GF小鼠获得了整个Sub小鼠的行为特征，这一事实证实了肠道菌群组成，脂肪组织生理学和社会行为之间的紧密联系。

肠道微生物群越来越被认为是大脑功能的潜在塑造者。这种效应是由肠-脑轴介导的，通过涉及代谢、营养、内分泌和免疫等方面的双向相互作用。微生物群-肠-脑轴的改变不仅参与中枢神经系统疾病的发展和行为紊乱，而且还参与社会行为的调节。特定的无病原体小鼠细菌移植到无菌（GF）小鼠，增加了后者的社交能力，而社交失败导致焦虑和抑郁样行为，与小鼠肠道微生物组整体多样性的变化以及特定细菌的相对丰度的降低相关。此外，慢性轻度应激改变了肠道微生物群并影响了小鼠的社交能力，最近的研究表明益生元可以减少啮齿类动物的焦虑样行为并改善其社交行为，同时伴随着微生物群组成的变化。GF动物的粪便移植研究表明，肠道微生物群可能在慢性炎症的发展中起到因果作用，这可能表现在脂肪组织病理学。然而，与肠道微生物群、脂肪炎症和行为直接相关的研究尚不多见。因此，本研究通过使用一个定义良好的社会支配和服从的小鼠模型，旨在评估上述相互关系。利用综合的行为和药理学方法，先前证明支配（Dom）和顺从（Sub）小鼠对精神药物和应激源的反应不同，具有不同的寿命，不同的脑神经化学，以及认知和学习能力。Dom与Sub小鼠之间的多方面差异导致在本研究开展前假设这些小鼠具有不同的肠道微生物组分，进一步可能通过诱导炎症导致脂肪组织生理稳态的改变而在形成其社会行为中发挥关键作用。本研究测定了成年Dom和Sub小鼠的肠道微生物群组成，并分析了它们附睾白色脂肪组织（eWAT）的各个方面。此外，通过将Dom或Sub小鼠的粪便微生物群移植到GF小鼠，证明了肠道微生物群在形成社会行为模式中的关键作用。这些肠道微生物组诱导的行为改变伴随着FMT驱动的eWAT代谢和炎症标志物的变化，这为社会行为的决定因素提供了新的见解。