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编译:如风,编辑:小菌菌、江舜尧。
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导读
早期的微生物定植触发了肠道成熟和免疫启动的过程。围产期因素,特别是与分娩有关的因素,包括分娩方式和分娩地点,对塑造婴儿肠道菌群及潜在的健康结局至关重要。
研究人员采用16S rRNA高通量测序分析方法,对180例健康婴儿(其中在家出生(HB)23例,在医院出生157例,其中剖宫产(CS)占41.7%)的出生时、出生后7天及1个月的粪便肠道菌群谱进行分析。同时,收集母乳喂养习惯和婴儿的临床数据,包括婴儿的身长、体重和抗生素暴露情况,直至18月龄。我们采用肠上皮细胞和先天免疫系统的体外长期个性化模型来评估肠道菌群的组成、功能和免疫反应之间的关系。微生物群的分布受分娩地点和方式的影响,它们对上皮/免疫细胞模型的免疫反应和肠道功能有明显的生物学影响。剖宫产婴儿的拟杆菌属和双歧杆菌属减少,在出生后的头18个月中,其BMI z分数和体重身长比(W/L)较高。与剖宫产相比,在家分娩者,分析其粪便上清时,发现肠道模拟上皮细胞具有更强的上皮屏障功能和更强的肠道成熟度,以及更高的免疫应答(TLR4通路激活和促炎细胞因子释放)。不同的宿主反应可能与不同的微生物群有关。分娩方式和分娩地点会影响新生儿肠道菌群,可能通过肠上皮的成熟、肠上皮屏障的调节以及生命早期先天免疫系统的控制来影响其与宿主的相互作用,且表型反应与婴儿的代谢过程有关。本研究对评估肠道菌群、功能与免疫之间的关系提供了研究依据,对母婴保健及肠道菌群研究具有重要的借鉴意义。
论文ID
原名:Perinatal environment shapes microbiota colonization and infant growth: impact on host response and intestinal function
译名:围产期环境塑造菌群定植和婴儿生长:对宿主反应和肠道功能的影响
期刊:Microbiome
IF:11.607
发表时间:2020.11
通讯作者:M. C. Collado
通讯作者单位:西班牙国家研究委员会农业化学和食品技术研究所(IATA-CSIC)
实验设计
本研究是一项前瞻性队列研究,以比较在医院(阴道产(VAG) n= 92和剖宫产(CS) n= 65)和在家(HB)(n=24)分娩婴儿的肠道菌群。对象包括出生时、7天和1月龄时有可采集生物样品的婴儿及其临床数据。在对象纳入之前,儿童家长应签署书面知情同意书,妇女应身体健康,新生儿应足月分娩,阴道产或剖宫产均无并发症出现。新生儿粪便样本在分娩后的最初24小时内由专业临床人员进行采集,随后,父母在孩子出生后1周和1个月时按照详细说明进行采集后及时运输至中心实验室。另外,工作人员还收集了孕期、分娩和人体测量等数据,以及婴儿出生时、1、6、12和18个月的身长和体重,并计算了人体测量值的z评分。
研究人员使用试剂盒提取粪便中的DNA,采用Illumina 方案制备16S rDNA基因宏基因组测序文库,扩增16S rRNA基因V3-V4可变区,建立DNA文库。引物确定后,在MiSeq-Illumina平台上对文库进行测序,对生物标志物的发现进行线性判别分析效应大小(LEfSe)分析。然后根据DNA可用性,使用部分样品进行qPCR的特异性细菌计数测定。研究人员分别培养了多种细胞并刺激部分细胞系,进行多次孵育、洗涤和处理,然后进行基因表达和细胞因子定量测定。然后测定上皮屏障功能、粘液的产生和肠道碱性磷酸酶(IAP),对细胞上清液中的细胞因子进行定量,通过实时RT-qPCR进行基因表达测定,分析了与微生物相关的作为TLR和相关转录因子的基因,以显示样品之间的稳定性高于肌动蛋白基因。
本研究采用卡方检验评估研究人群分类变量的差异,对连续变量采用ANOVA或Kruskal-Wallis及Dunn事后检验进行分析,通过Shapiro-Wilk检验对正态分布数据进行分析。然后将测序数据转化为相对丰度后进行下一步分析,还进行了α多样性分析、分类变量研究,并通过Kruskal-Wallis和Dunn的事后检验,以检测肠道微生物α多样性的显着差异及使用Spearman相关性来找到α多样性与人口连续变量之间的关联。使用变异性多元方差分析(PERMANOVA)方法进行β多样性分析,并根据不同研究变量对样品进行聚类。此外,本研究还进行了Kruskal-Wallis检验及RT-qPCR等分析。
结果
1 研究人群
两组新生儿体重没有差异,中位数为3250 g(范围2973–3573 g)。尽管所有的婴儿都是足月出生,但CS出生的婴儿均先于两组阴道分娩的婴儿(CS胎龄39周,VAG和HB胎龄40周)(p = 0.004)。在两种分娩模式下,HB新生儿比医院出生的婴儿体长更长(p = 0.003)。此外,HB婴儿在7天和31天内的纯母乳喂养率均高于医院分娩的婴儿(p < 0.001)。
2 与分娩地点和方式相关的围产期因素影响新生儿出生时的菌群组成及发育
出生时,分娩地点(医院与家庭)是影响新生儿微生物群组成的主要因素(p = 0.001),其次是出生方式(p = 0.025)(图1a)。其他围产期因素对分娩时新生儿菌群无显著影响。
图1 影响出生后第一个月新生儿肠道菌群的因素。在ASV水平下,新生儿(a)和婴儿第7天(b)和第31天(c)粪便微生物群的主成分(DAPC)判别分析。(d)出生后第一个月的菌群定植模式。
出生地点和方式在扩增子序列变异(ASV)级别上影响了微生物的丰富度和多样性。在医院出生的新生儿较家庭出生的新生儿菌群具有更高的丰度和多样性。CS组的物种指数(p= 0.023)、物种多样性(p=0.001)和物种丰富度(p= 0.031)均高于HB组。新生儿粪便菌群以变形菌门为主导,其次是厚壁菌门和放线菌门。另外,HB新生儿的微生物群富含肠球菌Enterococcus和葡萄球菌属Staphylococcus,而医院出生的婴儿富含Klebsiella,Veillonella和Clostridioides属。
在ASV水平下,出生方式(p = 0.001)和出生时间(p = 0.001)是影响新生儿出生第一个月菌群组成和结构的主要因素。新生儿出生时的菌群丰度(Chao1 index)和多样性(Shannon index)均显著高于出生后7天和31天。在医院出生(VAG和CS)和家庭出生的(HB)新生儿之间确定了不同的定植模式(图1d)。出生方式决定了微生物群在第7天(Adonis p < 0.001)和第31天(Adonis p < 0.005)的定植过程。在门和科水平上,VAG和CS分娩新生儿的微生物群发育不同(图1d)。在HB新生儿中,放线菌增加发生在分娩至31天,而在医院分娩的VAG新生儿,菌群增加从7天推迟至31天。阴道分娩(VAG和HB)第7天(p = 0.014)和第31天(p= 0.01)的拟杆菌门丰度略高于CS分娩。与医院出生的婴儿(VAG和CS)相比,HB新生儿的放线菌相对丰度更高(p= 0.004与p= 0.006,分别为第7和31天),变形菌的相对丰度更低(p= 0.026与p = 0.008,分别为7和31天)。
在阴道分娩(VAG和HB)的新生儿中,Collinsella和拟杆菌Bacteroides的相对丰度在第一个月内增加。大肠埃希菌属和肠球菌属则相反(图2)。CS分娩的婴儿中,大肠杆菌属Escherichia、肠球菌属Enterococcus和克雷伯氏菌属Klebsiella从出生到第7天和第31天增加(图2)。阴道产中双歧杆菌属Bifidobacterium的相对丰度高于CS产中双歧杆菌属Bifidobacterium的相对丰度。
图2 在出生后1个月内的粪便微生物群中最重要和可变属的相对丰度的差异。
3 围产期环境对18个月时婴儿体重状况的影响
CS出生婴儿的BMI和W/L z分数高于HB (BMI p =<0.001, 12月龄W/L z分数p < 0.001) 和在医院阴道分娩的婴儿(BMI p =<0.001, 12月龄W/L z分数p = 0.003(图3a,b)。
图3 出生地点和出生方式影响婴儿的生长发育。BMI z分(a) 和身长别体重W/L (b)z分从分娩到18个月龄的曲线,该曲线根据协变量调整了出生方式和地点、母乳喂养时间、出生后第一年的抗生素摄入量、产妇孕前BMI、婴儿BMI和出生时身长别体重(W/L)的z分。
4 出生后第一个月的肠道菌群预测功能受出生方式和地点的影响
推断出生时微生物功能主要受出生方式的影响(p< 0.001),但也受出生地的影响(p= 0.049)。此外,出生方式在第7天(p= 0.001)和第31天(p=0.02) 也会影响菌群;然而,仅在第7天具有统计学意义(p = 0.001)(图4a, b)。
图4 微生物功能计算预测新生儿在出生后第一个月的微生物群。a,b新生儿(a)和婴儿第7天、31天(b)粪便菌群的主成分(DAPC)判别分析。c,d使用新生儿出生后第一个月的粪便菌群计算分析了脂多糖(LPS)生物合成(c)及细菌毒素(d)含量
5 粪便上清诱导小肠上皮细胞TLR4和IRAK4mRNA表达
HT-29报告细胞在所有组中均表现出NF-kB激活增加,而不依赖于传递的位置和方式。与对照组细胞相比,所有粪便上清液均诱导HT-29细胞产生IL8和TNF-α(图5a)。两组之间没有发现任何细胞因子的差异。
图5 1月龄婴儿粪便上清暴露24小时后对上皮细胞系(a)和巨噬细胞样(b)细胞系的影响。
另外,发现HB粪便上清比CS粪便上清更能激发巨噬细胞样细胞的免疫应答,出生方式显著影响PMA分化的THP-1细胞中细胞因子的产生(图5b)。此外,CS粪便上清下调了TLR4(下调0.509倍,p= 0.006)和FOS mRNA表达(下调0.238倍,p= 0.038)。
6 宿主微生物相互作用的三重共培养系统
出生地点和方式对肠道屏障功能和成熟产生影响,关于细胞单层的完整性,与医院分娩相比,暴露7天后,HB促进了经上皮细胞电阻(TEER)值的增加(图6a, b) (VAG [p < 0.001],CS [p < 0.001])。从细胞顶端和基底室培养的上清液中也测定了肠道碱性磷酸酶(IAP)活性(图6e, f)。免疫系统应答方面,基础室对粪便上清的免疫反应普遍高于根尖室,在模拟肠道上皮细胞中,与无刺激对照(p= 0.01)和HB样本(0.45倍变化,p= 0.001)相比,暴露于CS出生的粪便上清降低了IRAK4 mRNA的表达(0.43倍变化)。
图6 粪便上清长期暴露(7天)对三联培养体系的影响。a、b上皮屏障功能:经上皮电阻值(TEER) (a)和荧光黄转运体(LY)(b)。c用Bradford法测定长期暴露于三重共培养系统中的LSTH17细胞产生粘液的情况。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了根尖室细胞(CacO-2和LSTH17)产生的白细胞介素IL-8,并与对照相比呈递增表达。e, f在最终时间点治疗期间以根尖腔内肠道碱性磷酸酶活性(IAP)测定的肠细胞功能成熟程度。g, h细胞在基础室由THP-1细胞产生细胞因子。粪便上清长期暴露后IL-8 (g)和IL-6 (h)的产生量与对照相比呈递增趋势。
讨论
在这项研究中,我们评估了剖宫产CS和在家生产HB及医院阴道产VAG婴儿在出生后第一个月肠道菌群的演变。我们的结果强调了围产期因素与肠道微生物定植模式的相关性,这会影响肠道固有的防御机制和功能成熟的过程。CS过程与特定的条件,包括使用抗生素、住院治疗时间更长、新生儿-母体接触较少和延迟母乳喂养,均可能影响微生物定植模式。
我们观察到出生的方式和地点(医院与家庭)对新生儿肠道菌群产生了影响。医院分娩婴儿的微生物群中富集了革兰氏阳性厌氧菌,包括Peptoniphilus和Finegoldia属,而HB婴儿的菌群相对丰度较高,主要来自肠球菌Enterococcus和双歧杆菌属Bifidobacterium。在所有三个组中,时间是影响婴儿菌群组成的主要因素,在出生时观察到的组间模式有显著差异,但在随后的时间点上没有差异。在分娩时,我们观察到新生儿微生物群的多样性指数高于随后的时间点;然而,分娩时,细菌总数的数量较低。
与先前的研究相似,我们发现CS出生的婴儿梭状芽胞杆菌和克雷伯氏菌相对丰度较高,而双歧杆菌相对丰度较低。我们观察到,VAG和HB婴儿均比出生于CS的新生儿具有更高数量的双歧杆菌。
描述性研究和观察性研究与了解新生儿期微生物群的进化有关;然而,仍然需要对生命早期宿主与微生物组相互作用的机理进行研究。因此,有人提出了微生物群功能分析作为澄清宿主-微生物组相互作用的工具。我们根据16S rRNA测序数据的基因组预测结果显示,在分娩时、第7天和第31天,婴儿菌群在不同出生地点和出生方式之间存在功能差异。我们还发现,阴道分娩的婴儿,尤其是HB婴儿,其微生物群富含LPS生物合成相关的功能。同样,Wampach等人发现了不同分娩方式的早期功能差异,包括与CS出生的新生儿相比,阴道分娩的LPS生物合成途径更为丰富。
尽管动物模型研究强调了微生物定植模式对宿主肠道上皮成熟和免疫系统反应的可能影响,但是从人体研究中获得的证据很少。据我们所知,本研究是解决这一重要问题的首批研究之一。肠道上皮是肠道微生物群-宿主交互作用的通道,通过肠上皮细胞的成熟、黏液的产生或上皮屏障的发育来影响肠道功能,也是宿主-微生物群相互作用的关键解剖学部位。HB婴儿的样品显示出比医院出生的婴儿(VAG和CS)更高的免疫刺激能力,并增强了免疫系统相关基因(TLR4和IRAK mRNA)的表达以及细胞因子应答的能力。在我们的模型中,随着时间的响应,HB粪便上清液诱导了更高的肠道屏障完整性和功能性(图6),突出了宿主与微生物组相互作用的动力学相关性。有趣的是,在接受配方奶喂养而非母乳喂养的早产儿中,肠道粘膜的封闭性受损,肠通透性也更高。这种通透性增加可能与非母乳喂养儿童的过敏性疾病和其他疾病有关。此外,HB组的样品诱导抗炎分子的(如IL10,TOLLIP)程度要比CS样本高,这表明对肠道炎症信号产生了负反馈。
然而,这些结果大多来自观察性研究,迄今为止很少进行机制分析。我们的结果表明CS与肠道功能和先天免疫系统的延迟成熟之间可能存在联系。这种联系可能在与干预分娩相关的疾病,包括自身免疫、过敏和其他与免疫和代谢相关的疾病中发挥重要作用。在这方面,我们队列中CS出生的婴儿在生命的前18个月中显示出较高的BMI和W/L z得分。其他研究人员也报告了类似的结果,将CS与儿童的超重风险联系起来。这些结果可以表明婴儿健康优先事件的相关性,包括那些改变微生物定植的事件,从而支持早期规划假说。
本研究的局限性包括参与者人数少,以及分析中未包括的可能混杂因素(例如,产妇饮食、生活方式或兄弟姐妹、宠物的数量等)。我们的菌群分析基于16S rRNA基因测序技术,其精度低于宏基因组测序结果。无菌粪便上清液及细胞系的操作同样影响分析结果。本研究的优势主要包括将三组对象纳入研究,比较医院和家庭中CS和阴道分娩的情况,包括18个月的随访情况。我们还在具有不同复杂程度和不同暴露时间的细胞模型中进行了细胞暴露测定,包括将上皮屏障功能和成熟程度包括先天免疫应答作为相关靶标,并使用无菌粪便上清液进行进一步研究。
结论
尽管不能排除其他混杂因素,但我们的结果可能在CS和免疫相关疾病与菌群定植模式改变相关的研究之间建立机制联系。本研究揭示了在医院和家庭分娩对新生儿微生物定植的影响以及对先天免疫系统发育尤其是在肠道水平的可能影响。研究结果既强调了生命第一个月与宿主微生物接触的重要性,也强调了这个过程的动态性。然而,需要进一步的研究来确定这些观察对新生儿体内临床特征的影响。这些发现将有助于设计调整医疗实践的策略,以减少分娩过程中的干预,并确保正确启动细菌定植过程,从而在生命早期产生免疫系统反应。
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