原名：Protistsas main indicators and determinants of plant performance

译名：原生生物是植物生长性能的主要指标和决定因素

期刊：Microbiome

IF：11.607

发表时间：2021.3.20

通讯作者：李荣

通讯作者单位：南京农业大学教育部资源节约型肥料工程中心，植物免疫重点实验室

本实验中，长期连作田始于2014年3月，位于中国江苏省南京市蔬菜科学研究所（北纬31°43′，东经118°46′）。其位于亚热带季风气候区，年平均气温为15.4^oC，年平均降雨量为1106 mm。

黄瓜是自2014年3月至2016年10月连续种植的农作物，采用随机化完全模块设计进行处理，每种肥料处理均重复三遍。四种施肥方法是：Ctrl，未经施肥改良的土壤；CF，用化肥改良的土壤；OF，用有机肥和高炉改良土壤和BF，用生物有机肥改良土壤。表S1中列出了详细的施肥方案（六季平均施肥量）。有机肥料是包括动物尸体和鸡粪堆肥中液态氨基酸在内的混合物，比例为1：5（v/w）。生物有机肥料由干重约为5.0×10⁷CFU的生防木霉NJAU4742 g^-1干肥构成。在这里，生防木霉菌株NJAU4742具有很强的促生长能力，是在中国广泛使用的商业生物制剂。在黄瓜种植之前，使用旋耕机施用不同的肥料，并且在整个实验过程中均采用相同的处理方式。在2014年6月（以下称为“作物1”）、2014年10月（“作物2”）、2015年6月（“作物3”）、2015年10月（“作物4”）、2016年6月（“作物5”）和2016年10月（“作物6”）的整个生育期内采集土壤样本并检测作物产量。对于每个重复样本，使用25 mm土壤钻从5 cm深的8个随机土壤核心中生成复合土壤样本。将样品彻底均质并通过2 mm筛孔筛进行筛分。将每个样品的一部分风干以进行化学分析，另一部分保存在-80°C以便随后进行DNA提取。

1 作物产量与土壤微生物群落对产量的贡献

与对照相比，在所有六个连续种植季中，所有肥料的施用均增加了农作物的产量（P<0.05；图S1a）。在四季合计（P<0.05；图1a）和每个季节内（图S1a），OF和BF的作物产量均高于CF。在所选择的微生物指标中，原生生物群落结构是解释所有处理组作物产量的最佳微生物参数(P<0.05)，可解释11.56%的观测变异(图1B)。相反，无论是细菌或真菌的群落结构，还是任何微生物类群的多样性都与产量没有显著联系(P>0.05；图1B)。

图1. 不同施肥方式对作物产量的总体影响（a）。细菌、真菌和原生生物多样性以及群落结构对作物产量的相对重要性（b）。施肥方式对细菌、真菌和原生生物群落结构的影响（c）。在图（a）中，字母不同的条柱表示Tukey’sHSD检测界定的显著差异（P<0.05）。Ctrl：未施用化肥的土壤；CF：施用化肥的土壤；OF：施用有机肥的土壤；BF：施用生物有机肥的土壤。在图（b）和（c）中，***表示P<0.001。使用线性模型通过多元回归来计算解释力的统计显著性。通过PERMANOVA分析计算效应值（R²）和统计显著性。

2 微生物多样性与群落结构

施肥方式影响所有微生物群的群落结构，对原生生物的影响最大（原生生物：R²=0.135，P=0.001；细菌：R²=0.111，P=0.001；真菌：R²=0.123，P=0.001）（图1c、图S1b和表S2）。原生动物的α多样性受施肥的影响很小（F=3.944，P=0.053），而细菌（F=0.881，P=0.491）和真菌（F=2.166，P=0.170）的α多样性没有改变（表S3）。与CF相比，处理组间α多样性的唯一显著差异是OF中的原生生物多样性更高（P<0.05；图S1c）。所有施肥处理的原生生物多样性变化均高于对照处理（图S1d）。由于原始生物对施肥反应最强烈，并且考虑到它们与产量的联系，因此我们将后续分析重点放在原生生物上。

3 原生生物分类和功能组成的潜在驱动因素以及与产量的联系

在原生生物功能组中，只有微生物消耗型原生生物与产量呈正相关(P<0.05；表S4)。与对照相比，BF中微生物消耗型原生生物的相对丰度增加了4.28%（P<0.05），而其他处理之间没有显著差异（图S1e）。仅在CF中，微生物消耗型原生生物的相对丰度随时间显著降低（P<0.05；图S1f）。此外，与化学施肥处理相比，在（生物）有机施肥处理（有机和木霉生物有机施肥）中微生物消耗型原生生物的相对丰度变化较小（图S1f）。我们利用SEM进一步确定了产量与微生物消耗型原生生物、细菌和真菌之间的潜在联系。该分析表明，通过与细菌（P<0.01；路径系数=0.316）和真菌（P<0.05；路径系数=0.218）的相互作用，微生物消耗型原生生物与产量直接相关（P<0.05；路径系数=0.287）（图2a）。对施肥引起的微生物消耗型原生生物变化的潜在非生物因素的分析表明，土壤pH是8种土壤理化性质的主要影响因素（P<0.05；图S2a、b和c）。

图2. 结构方程模型（SEM）说明了细菌和真菌丰度与微生物消耗型原生生物相对丰度对作物产量的关系（a）。热图表示在所有处理中微生物消耗型原生生物的OTUs的相对丰度与作物产量的相关性（b）。在图（a）中，*表示P<0.05；**表示P<0.01。实线和虚线分别表示显著和非显著关系，蓝色箭头表示正关系，红色箭头表示负关系。与线相关的数字表示路径系数，线宽与效果大小成正比。低卡方（χ2=0.458），高拟合优度指数（GFI=0.797），低Akaike信息标准（AIC=18.458）和低均方根近似误差（RMSEA=0.000）表明我们的数据与我们的假设模型相符。在图（b）中，颜色键将热图颜色与标准分数（z分数）相关联。加号表示OTUs与作物产量之间的正相关，而减号表示负相关。不同的字母表示Tukey’sHSD检测的显著差异（P<0.05）。圆圈与所有样本中每组的平均相对丰度成正比。

14种微生物消耗型原生生物的OTUs与作物产量呈正相关，包括9种尾蚴（cercozoan）、4种纤毛虫（ciliophoran）和1种赭藻类（ochrophytan taxa）（图2b）。其中，与对照组和CF处理组相比，cercozona OTU124（Cercozona，Cercomonas）、OTU4169（Cercozona，Euglyphida_XX）和OTU58（Cercozona，Rhogostoma−lineage_X）在OF和BF中显示出相对较高的相对丰度（P<0.05；图2b）。进一步用Spearman相关分析确定这些微生物消耗型原生生物与细菌或真菌之间的潜在联系，表明OTU124与木霉（F_OTU2929）和曲霉（F_OTU14）正相关，OTU4169与假单胞菌（B_OTU1，B_OTU1938）和曲霉（F_OTU14，F_OTU23）正相关，而OTU58与镰刀菌呈负相关（F_OTU3）（图S2d）。

4 微生物消耗型原生生物分离株对植物生长的促进作用

我们的第一次温室实验旨在从机制上理解田间研究中观察到的原生动物群落和作物产量之间的联系。我们发现，与天然对照土壤相比，所有微生物消耗型原生生物都增加了黄瓜的生物量（P<0.05），但在无菌土壤中情况并非如此（图3a）。对植物生长性能产生最大积极影响的是两种尾蚴类群Cercomonas lenta（增加165%）和Cercomonas S24D2（增加138%）（图3a）。与对照组（64%）相比，非尾蚴类微生物消耗型Allovahlkampfia sp.也增加了植物生物量，但低于Cercomonas lenta和Cercomonas S24D2（图3a）。在第二次温室实验中，证实了两种尾蚴物种Cercomonas lenta和Cercomonas S24D2对植物生长性能的积极影响，结果表明它们的植物生物量分别比对照增加了101%和79%（图S3）。

图3. 在第一次温室实验（a）中，接种不同微生物消耗型原生生物的处理中，黄瓜生物量相对于对照的倍数变化（第二次温室实验的验证性实验见图S3）。第三次温室黄瓜生物量实验研究了接种微生物消耗型原生生物（b）促进木霉菌生长的能力。在图（a）中，对照组表示未接种原生生物；S_表示将原生生物接种到无菌土壤中。在图（b）中，对照组表示没有接种微生物；S_表示将原生生物和真菌接种到无菌土壤中。T：木霉菌；T+C：木霉菌+Cercomonas lenta。星号表示各处理黄瓜生物量与对照相比差异显著（Student'st检验，***表示P<0.001；**表示P<0.01；NS表示不显著）。P值表示在Student'st检验下T和T+C之间的显著性，或S_T和S_T+C之间的显著性。

第三次温室实验旨在探索微生物消耗型原生生物和木霉菌（生物制剂添加到BF处理的有机肥料中）之间的潜在相互作用。在无菌土壤中，当接种木霉时不使用原生生物（S_T；比对照增加193％）和木霉菌+原生动物接种（S_T+C；197％）时，可以观察到对植物生长性能的最强积极的作用（P<0.05；图3b）。在天然土壤中，与T相比，T+C显著增加了植物生物量（P=0.028），而与对照相比，T和T+C分别增加了140%和196%的植物生物量（P<0.05；图3b）。

1 我们发现原生生物，尤其是微生物消耗型，是受施肥处理影响最大的微生物。原生动物群落以及特定的原生动物类群大多通过与细菌和真菌群落的相互作用有力地解释了作物产量的变化。我们的研究结果表明，原生生物群落在决定植物生长性能方面扮演着以前被忽视的角色，它至少可以与土壤和根际微生物群研究中通常针对的细菌和真菌群落同等重要。这丰富了先前的研究，即原生生物是对施肥最敏感的微生物，也是植物健康的最佳微生物群落决定因素。事实上，我们在这里展示了原生生物群落和植物产量之间潜在的积极联系的证据，这一发现得到了温室研究结果的支持，这些研究表明原生生物诱导的植物生长的增加。不同的原生生物群落和物种的重要性可以通过特定物种的原生生物摄食差异来解释，这可能会具体形成一个植物生长促进型微生物组。

2 通过施肥改变非生物土壤参数，特别是相关的土壤酸化，是原生生物多样性、群落结构和功能组成变化的驱动力，这证实了非生物参数作为原生生物群落的全局和局部决定因素的重要性。事实上，我们的研究表明，pH值在局部尺度上构建原生生物的重要性可能与局部和全球尺度上的土壤水分相似。尤其是作为主要的土壤原生功能群的吞噬微生物消耗者，对土壤理化性质的变化反应强烈，部分原因可能是细菌和真菌捕食群落的共存变化。在有机肥中添加木霉菌(BF处理)也影响了原生生物群落，证实了微生物的引入可以改变原生生物群落。我们的结果也显示了细菌群落和原生动物之间的紧密联系，正如之前反复提到的，突出了原生生物是土壤细菌的主要捕食者。我们还展示了真菌和原生生物之间的联系，这可能与它们作为重要食真菌动物的新兴作用有关。这种古老的共同进化的捕食者-猎物关系可能导致了上述物种特定的摄食差异以及高度复杂的拮抗机制，在这些机制中细菌和真菌可以防御捕食者。

3 有机肥富含微生物消耗型原生生物，特别是尾蚴类群，与田间植物产量之间的紧密联系可能是由多种效应综合作用的结果，其中包括提高养分周转率、促进植物有益微生物的生长和控制植物荷尔蒙平衡。事实上，微生物消耗型原生生物通过捕食有害植物的微生物来增强植物的生长性能，或者通过捕食它们的竞争者来提高植物生长促进性微生物的性能。我们的温室实验证实了摄食微生物的原生生物(Cercomonas lenta；Cercomonas S24D2；Allovahlkampfia sp.)对植物生长有积极的促进作用，特别是全球最丰富和功能最重要的土壤原生动物之一尾蚴(Cercozoa)。这里观察到的这些尾蚴类群可能通过与植物病原菌（镰刀菌）的负相关和与植物有益微生物（假单胞菌、木霉菌和曲霉）的正相关来增加植物产量，我们在温室实验中强调了这一联系（图3b）。

4 我们的第三次温室实验为木霉菌在增强植物生长性能方面的功能重要性提供了直接证据。木霉菌在无菌土壤中比在自然土壤中对植物生长性能有更强的正效应，这表明与其他土壤生物的竞争性相互作用降低了木霉菌的正效应，而其他土传病原菌也可能直接抑制植物生长。“S_T”和“S_T+C”之间无显著差异，表明Cercomonaslenta可能没有与木霉菌直接相互作用。与“T”相比，“T+C”对植株生长性能产生的正向效应更强，这表明Cercomonas lenta可能增加木霉在天然土壤中的竞争能力，从而增加其对植物生长性能的正作用。这些结果为通过原生生物和有益植物真菌相结合来操纵土壤微生物群提供了一个新的视角，这可能有助于以可持续的方式增加农业生态系统的功能。

我们展示了原生生物群落，特别是微生物消耗类群，通过其对植物有益微生物的特异性增强，而成为作物产量的重要微生物决定因素。微生物消耗型原生生物代表受施肥影响最大的微生物群。因此，这些原生生物可能成为操纵有针对性和环境友好的微生物组的有力工具来增加农作物产量。我们强调有必要将原生生物纳入旨在评估生物有机肥应用所涉影响和机制的研究中，并且未来的研究应该评估原生生物作为生物添加剂的使用情况，以开发可持续的原生生物支撑的植物生长促进新策略。