编译：yl，编辑：小菌菌、江舜尧。

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自闭症谱系障碍（ASD）具有是一种具有遗传风险的疾病。ASD儿童患有一系列胃肠道（GI）症状，例如胀气、腹泻和便秘，ASD和GI症状的关联促使人们探索肠道微生物组在ASD发病机理中的作用。肠微生物群作为肠道生理、神经免疫和宿主行为的重要调节因子，很多研究报道了ASD个体中肠道菌群失调。例如，研究发现ASD患者中的Sutterella、Desulfovibrio、Bacteroides vulgatus、Akkermansia、Prevotella、Coprococcus和Firmicutes的丰度发生了变化。

最近的研究表明，宿主遗传学在整个微生物组群和单个细菌分类群的形成中都起着重要的作用。然而，关于宿主遗传变异、肠道微生物群代谢物、ASD免疫系统的详细关联尚不清楚。为探讨ASD宿主基因组-微生物群相互作用的性质和程度，对26例ASD伴便秘的ASD患者和26例配对的典型发育儿童(TD)进行外显子测序。并与TDS进行比较，去除在ExAc、1000Genome database和中国Millionome数据库(CMDB)中等位基因频率在5%以上的单核苷酸变异（SNVs），鉴定富含SNVs的ASD。然后对粪便微生物群、粪便代谢物和血清细胞因子进行表征，分析其与SNVs的关系。此外，还推断了宿主SNVs与肠道微生物的因果关系。功能性遗传变异、肠道微生物群、代谢产物和细胞因子的关联分析可以为揭示ASD疾病的发病机制提供新的的线索。

1 ASD中的SNVs与肠道微生物群相关

通过使用匹配的 TD 队列和公共数据库作为对照，在ASD 队列中共识别出 567个外显子SNVs。这些SNVs的突变模式(图1 ( a ) )和突变特征(图1 ( b ) )与自闭症谱系障碍遗传证据知识库AutismKB中报道的ASD相关突变相同。我们使用主成分分析 （PCA） 计算宿主 SNVs基因型数据的变异坐标。然后，我们计算了α多样性，一种样本内微生物多样性的方法（Simpson 指数）。我们发现，功能SNVs（蛋白质改变SNVs，包括非同义的、停止增益和停止丢失SNVs）的首次协调与肠道微生物群的α多样性显著相关（图1（c），R= 0.45，P = 0.020）。α多样性改变与自闭症在内的许多人类健康疾病有关。对宿主遗传学与肠道微生物群整体组成的关系进行分析，发现功能SNVs的第一主坐标与微生物PC1之间观察到轻微显著的相关性（图1（c），R = 0.37，P= 0.059）。而在富集全部的SNVs时，未发现宿主遗传学与微生物群多样性或组成之间的显著相关性。这些相关性表明功能性SNVs和微生物群之间的潜在关系。

我们对26个ADS个体和26个TD的粪便样本进行了宿主基因组全外显子测序、全基因组猎枪测序和代谢产物图谱。对遗传变异和微生物，以及微生物基因、代谢物和途径以及宿主免疫之间的关联进行了测试。

图1 SNVs在自闭症儿童中的富集。（A-B）比较我们识别的SNVs和AutismKB数据库中的突变模式（A）和突变特征（B）。（C）宿主遗传数据的第一PC(x轴)与α多样性（左侧）或粪便微生物群第一PC (右侧) 的相关性。（D）Circos 图：ASD中富含的功能SNVs。点的高度表示突变样本的数量。圆外标记SNVs定位基因。（E）本研究中ASD的SNVs基因与其他研究数据重叠。（F）功能SNVs基因的功能注释。

功能性SNVs定位于206个基因（图1（d）），包括70个先前报道的基因，如MUC4、SETD5和ANKRD11 (图1（e））。这些基因的功能富集分析表明，蛋白质糖基化过程、先天免疫反应和维甲酸代谢过程均有显著富集（图1（f））。MUC家族基因编码的粘蛋白是O-糖基化蛋白，在上皮表面形成保护性粘液屏障方面起着至关重要的作用，粘蛋白是粘膜感染的先天和适应性免疫反应的组成部分。越来越多的证据表明，编码糖基化细胞外蛋白或酶（糖原）基因的变异可能与ASD的病因和发病机制有关。例如，黏蛋白编码基因MUC4和糖基转移酶B3GALNT2。在小鼠先天性糖基化障碍(CDGS)模型和在CDG患者中观察到的行为表型的研究支持了糖原基因变异可能导致或促进特发性ASD发展的观点。 维甲酸是维生素A及其衍生物，维甲酸信号在调节神经分化、神经突起生长、神经管前后轴图形化、神经递质释放和长期增强等脑功能中起着重要作用。阿尔茨海默病的病理已经证实了视网膜样信号的缺陷，据报道，维生素A缺乏会加重ASD儿童的症状。

2 SNVs与细菌类群相关

在对年龄和性别等混杂因素进行调整后，使用标准线性回归系统地筛选了各功能SNVs与物种丰度之间的关联，确定了46个关联（图2）。在结果中，糖基转移酶B3GALNT2（chr1：235659576，c.C155T，p.A52V）的变异与ASD儿童中的Catenibacterium mitsuokai的丰度增加有关。PGLYRP4（rs148195147，c.G602A，p.R201Q）的变异与Faecalibacterium prausnitzii有关。 PGLYRP4是先天免疫系统的一部分，它编码了一种已知的抗菌蛋白，可识别肽聚糖。PGLYRP4的缺乏导致肠道微生物群的变化。免疫相关基因参与的其他关联包括CD180变异(chr5:66479217、c.C1454A、p.T485N )与Bacteroides dorei和 Clostridium sp相关。CAG:7、RAET1G变异( rs4870111, c.G668A, p.R223K )与两种拟杆菌属以及Catenibacterium mitsuokai相关，而RTN4变异与Hungatella hathewayi相关。CD180是一种TLR相关分子，主要在巨噬细胞、DCs和B细胞上表达，它还可以感应细菌LPS，从而触发休眠多发肌细胞的生长。  ASD组中RAET1G和RTN4也发生突变。 RAET1G编码主要组织相容性复合物（MHC） I 类蛋白质，它是自然杀伤细胞2D（NKG2D）受体的配体之一，在先天免疫和适应性免疫中起激活受体的作用。对于核酸感应TLRs引发的免疫反应是必需的。此外，RTN4也是中枢神经系统中轴突再生的抑制剂。

图2 与微生物相关的SNVs。通过回归鉴定的 SNVs-微生物关联。SNVs定位于基因。节点的大小与基因或微生物涉及的关联数成正比。

此外，载脂蛋白B和RARRES2是参与维甲酸代谢过程的两个基因，分别与Lachnospiraceae bacterium 7_1_58FAA 和 Bacteroides eggerthii的丰度有关。载脂蛋白B是抗细菌感染的天然屏障，在自闭症中观察到新的APOB突变。据报道，Bacteroides eggerthii 可以增强小鼠的结肠炎。研究表明，在ASD儿童中，Bacteroidetes/Bacteroidales是与维生素A相关的主要类群之一。

先前的研究表明ASD的遗传风险可以部分通过表达数量性状基因座发挥作用，即eQTL和表观遗传调控，比如meQTL。因此，我们探讨了微生物与eQTL或 meQTL SNVs之间的关联。在本研究的ASD队列中，有30个SNVs是神经精神障碍的eQTL或 meQTL位点（图3（a））。这些基因座中有少数与微生物有关（图3（a））。非编码RNA LOC285819（rs34104395）外显子变异，对结肠和脑组织BTN3A2均有eQTL效应，与Clostridium sp.L2-50相关。BTN3A2是免疫球蛋白超家庭的成员，BTN3A2的表达增加可能通过改变兴奋突触功能增加患精神分裂症的风险。

图3 QTL SNVs与微生物通路的关系，SNVs、微生物和代谢物之间的因果关系。（A） eQTL/meQTL位点与微生物之间的关联，以及调控的基因。（B） SNVs（基因）与微生物通路（KEGG通路，水平3）之间的联系。

3 宿主SNVs与微生物途径和微生物基因丰度相关

为了评估宿主SNVs如何以及多大程度影响微生物组的功能，测试了SNVs与微生物通路和基因之间的关联。我们确定了13个宿主基因和20个微生物通路之间的22个联系（图3b）。几种变异与代谢途径有关，例如MUC3A (chr7:100550525, c.C1106T, p.P369L; chr7:100550534, c.C1115G,p.S372 C) 和ANKRD20A2/3 (Ankyrin Repeat Domain 20 Family Member A1, rs201420500, c.C2456A,p.S819Y) 与脂质代谢途径有关；LAMTOR1变异(rs146341570, c.C374T, p.P125L)与Lysine降解相关。值得注意的是，PLCG2 (rs201080992, c.C579G,p.H193Q) 和ALDH1A (rs8187929, c.A529T, p.I177F)与外源生物降解和代谢的通路有关。 ALDH1A1是一种多功能酶，具有脱氢酶、酯酶和抗氧化活性。此外，PLGG2与小胶质细胞介导的阿尔茨海默病的先天免疫有关。

4 SNVs、微生物群及其代谢物的因果关系

微生物调节宿主生理的关键机制之一是通过其代谢产物。 为了破解宿主SNVs对ASD中微生物及其代谢产物的影响，Millstein等人提出了因果推理试验(CIT)。 应用该方法推断SNVs、微生物及其代谢产物之间的因果关系。重点关注与前一节中确定的特定微生物相关的SNVs，8种SNVs-微生物-代谢物，包括4种SNVs-微生物和8种代谢物(图4(a))。

图4 SNVs、微生物和代谢物之间的因果关系。（A） 由因果推理检验推断SNVs-微生物-代谢物的因果关系。红色和绿色分别表示正相关和负相关。（B）PGLYRP4a SNVs状态与Faecalibacterium prausnitzi 丰度的相关性，以及Faecalibacterium prausnitzi 、Dopaquinone和 2ʹ-Deoxyguanosine的联系。 （C）LILRA6 SNVs 状态与Bacteroides ovatus丰度的相关性，以及 Bacteroides ovatus 、Desaminotyrosine、Tyrosyl-Leucine和3-(Uracil-1- yl)-L-alanine的联系。

推测的因果关系网络中有三种代谢产物参与色氨酸和酪氨酸的代谢，即酪氨酸-亮氨酸、Dopaquinone和Desaminotyrosine。Dopaquinone的含量与PGLYRP4 (rs148195147, c.G602A, p.R201Q)的变异和Faecalibacterium  prausnitzii 的丰度有关（图4（b））。此外， Faecalibacterium prausnitzii与2ʹ-Deoxyguanosine（一种参与叶酸生物合成通路中的代谢物）的水平有关。LILRA6 (rs56257556, c.A931 G, p.N311D)变异通过Bacteroides ovatus与Desaminotyrosine、酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸代谢产物3-(Uracil-1-yl)-L-alanine 联系(图5(C))。LILRA 6是一种白细胞免疫球蛋白样受体，在天然免疫系统和Ⅰ类MHC介导的抗原处理和呈递过程中起着重要作用。在ASD中曾观察到LILRA 6的新突变。

5 细胞因子与宿主遗传学和微生物群的关联

最新研究表明，免疫功能障碍是导致在SED中观察到的神经发育缺陷的一个危险因素。然后，我们测试了血清中7种细胞因子的水平。与先前的研究一致，ASD儿童的IL-1β、IL-4、IL-17α、IL-10以及TGF-β 水平明显高于TD（图5（a））。一些研究表明，宿主基因可以通过异常的免疫激活重塑肠道微生物群及其代谢物。通过测试遗传变异与不同细胞因子之间的关联，所有五个差异表达细胞因子的水平与SNVs相关（图5（b））。包括已知的 ASD 相关基因MUC2、MUC4、SETD5、MUC5B、INO80D、SEPT9、PGLYRP4、DST和CHD6等。此外，所有五种细胞因子都与微生物和代谢物相关（图5（c-d））。这些结果表明，肠道微生物-代谢物和宿主遗传学的相互作用可能在ASD儿童异常免疫活化中起到至关重要的作用。

图5 ASD中的细胞因子及其与基因、微生物和代谢物的关系。（A）ASD和对照样本中细胞因子的水平。（B）SNVs(基因)与细胞因子的关联热图。（C） 微生物与细胞因子之间的关联热图。（d） 代谢物与细胞因子之间的关联热图。

本研究首先从宿主遗传、微生物组成、微生物基因丰度、微生物代谢产物、宿主免疫等方面研究了宿主与肠道微生物的相互作用。我们对宿主遗传变异与肠道微生物在ASD发病过程中的相互作用提供了新的认识（图6）。

图6 宿主遗传学、肠道微生物、粪便代谢物和细胞因子之间相互作用的综述。

许多最近的研究都强调了 ASD 与肠道微生物群之间的联系。鉴于ASD 是一种受遗传和环境因素影响的疾病，因此在宿主遗传变异的背景下研究微生物组是很有意义的。我们联合分析了ASD的SNVs图谱、粪便微生物组的分类组成及其代谢产物，以及宿主细胞因子。我们发现微生物组的组成与功能性SNVs相关。ASD发生时，位于糖基化过程、先天免疫反应和维甲酸代谢过程相关基因中的功能性SNVs显著富集，提示参与这些生物学过程的蛋白功能异常可能与ASD的发病机制有关。与此一致，本研究中招募的受试者都有便秘症状，样本中发现的SNVs富含与肠道功能相关的基因，，例如粘蛋白基因（MUC2、MUC3A、MUC4和MUC5B）。粘蛋白可作为肠道免疫的保护性屏障或腔内传感器，调节肠道微生物群。此外，在用Lubiprostone治疗慢性便秘时观察到胃黏液蛋白增加。更重要的是，在多个ASD队列中报道了粘蛋白基因突变。本研究通过功能性SNVs与微生物的相关性分析，揭示了MUC家族基因中的SNVs参与了便秘型自闭症患者肠道菌群的相互作用。

免疫功能障碍是导致ASD神经发育缺陷的危险因素，许多自闭症易感基因与免疫/感染途径有关。同时，微生物影响外周免疫细胞的激活，并导致神经行为和神经退行性疾病，如ASD、焦虑抑郁症、阿尔茨海默病和帕金森病。在这项研究中，我们发现免疫相关基因变异和肠道微菌群之间有关联。例如，位于PGLYRP4、APOB、CD180、RAET1G和LILRA6中的变异与多种菌群有关，主要是 Bacteroides，其丰度在多项ASD研究中发生了改变。这说明宿主基因塑造了肠道微生物，并表明在自闭症谱系障碍的背景下，免疫和微生物之间存在相互作用。然而，对于其他类型的SNVs (基因间、上游/下游、内含子和非编码外显子)，有数十个SNVs被定位到eQTL或meQTL位点，这些SNVs的数量有限，与微生物的丰度有关(图4(a))。关于这一观察结果，有两种可能。首先，ASD中基因变异和肠道菌群丰度之间的相互作用可能主要通过功能丧失(LoF)基因变异发生。另一种可能的解释是，由于我们研究的样本量较小，没有足够的统计能力来检测由eQTL或meQTL基因介导的SNVs与微生物之间的间接关联。在这种情况下，通过增加样本量，我们可能预期观察到的非功能性SNVs和肠道微生物之间的关联数量增加。

在宿主SNVs与肠道微生物通路和基因之间的关联分析中，我们观察到SNVs与免疫系统和代谢途径之间有显著关联。代谢物在肠道微生物群和宿主细胞之间充当信息的传递者。代谢物作为肠道微生物群和宿主细胞之间的信息信使，其存在取决于微生物的代谢活动，可以影响宿主的发育、健康和发病机制。据报道，TD和 ASD 个体之间的氨基酸代谢存在差异。宿主SNVs与氨基酸代谢相关的微生物基因之间的关联表明，ASD宿主遗传变异以微生物介导的方式影响神经发育和行为的机制。因果推理测试还确定了与神经递质代谢中代谢水平相关的多种遗传变异。这一结果为ASD的遗传易感性提供了一种可能的机制。为了更准确地识别变异，我们只考虑在两个以上样本中检测到的变异。

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