原名：Biochar with large specific surface area recruits N₂O-reducing microbes and mitigate N₂O emission

译名：大比表面积的生物炭通过刺激N₂O还原微生物的生长从而降低N₂O的排放

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.03.13

通讯作者：张振华

通讯作者单位：湖南农业大学资源环境学院

1. 生物炭的理化和形态特征

本研究生物炭的主要理化性质如表S2所示。B1，B2和B3中灰分物质、元素（C、H和O）和养分（N、P和K）含量相似。扫描电镜图片显示，B3比B2和B1有更丰富的多孔结构（红色箭头处，图1a）。生物炭的比表面积（SSA）、总孔体积（V_T）和总孔直径（Dp）排序为：B3> B2> B1（图1b-c）。

图1. 不同生物炭（生物炭1：B1，生物炭2：B2和生物炭3：B3）的扫描电镜图（SEM）（a）、比表面积（b）、总孔体积（c）和总孔径（d）。（a）中的红色箭头表示生物炭的多孔结构，其可作为微生物的潜在栖息地。

2. 氧化亚氮的排放

添加SSA最小的生物炭添加SSA（B1）的土壤中N₂O排放速率最快，分别比仅添加尿素（+N）和中等SSA生物炭（B2）土壤中N₂O排放分别提快两天和四天，其次是SSA最大的生物炭处理（B3）的土壤。N₂O排放量与生物炭SSA呈负相关关系，即B1处理（3055 μg N m⁻²·h⁻¹）>B2处理（2272 μg N m⁻²·h⁻¹）>+N处理（1788 μg N m⁻²·h⁻¹）>B3处理（1068 μg N m⁻²·h⁻¹）。

56天培养结束后，不添加尿素和生物炭处理的土壤中N₂O累积排放量最低（图2b），最小SSA的B1处理N₂O累积排放量最高（578.7 mg m^-2），这是仅尿素处理土壤（+N）的1.6倍。另外，与+N处理相比，中等SSA的B2处理中N₂O累积排放量增加了45%，而最大SSA的B3处理中N₂O累积排放量减少了37%。

图2. 在56天的培养过程中，5个处理的N₂O排放量的动态变化（a）、总累积量（b）,以及NH₄⁺和NO₃^-含量的变化。不同处理之间的统计学差异由小写字母表示（p<0.05）。Control表示不添加对照，+N表示仅添加尿素，NB1，NB2和NB3表示不同比表面积的生物炭与尿素的组合。

3. 土壤pH和无机氮

尿素和生物炭添加显著影响土壤pH（图S1）。培养过程中（第3天除外），+N处理降低了土壤pH值。生物炭添加下，土壤pH降低速度变缓，但此时pH值仍高于不添加生物炭的+N和Control处理。

土壤NH₄⁺-N含量随氮肥添加而增加，但与Control相比，其他处理在培养前14天呈明显下降的趋势，随后达到相对稳定的水平（图2c）。相反，与Control相比，其他处理土壤中NO₃^--N含量较高且在前14天呈明显增加且随后相对稳定的趋势（图2d）。培养第7天后，生物炭SSA>2023 m²g⁻¹的处理中NO₃^--N含量低于过生物炭SSA<2023 m²g⁻¹和只添加尿素的处理。在培养的前14天内，添加氮肥（尿素）的处理中NH₄⁺-N含量迅速降低而NO₃^--N含量迅速增加。

4. 氮肥与生物炭添加对土壤细菌群落组成的影响

PCA分析表明不同处理的细菌群落组成存在显著差异（图3a）。PCA1轴和PCA2轴分别解释了OTU数据的62.5%和22.6%，累积解释率为85.1%。PCA1轴将未添加生物炭的Control和+N处理与添加生物炭的NB1~NB3处理的细菌群落分开。相比Control处理，+N与NB1~NB3处理中土壤细菌的α多样性（香农指数）较低（图3b）。然而，最大SSA的NB3处理的Chao 1指数高于Control和+N处理（图3b）。

最丰富的细菌门分别是变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）和WPS-2菌门，这些菌占土壤中所有细菌的91％以上（图3c）。生物炭添加增加了土壤中纤维杆菌门（Fibrobacteres）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、棒状杆菌门（Rokubacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形杆菌门（Proteobacteria）的相对丰度（图S2）。）。50%以上的细菌OTUs丰度因生物炭的添加而增大，也有50%以上的细菌OTUs丰度在只添加尿素或零添加的处理中较高的，尽管后者差异不显著（图3d）。CCA分析表明，生物炭添加通过影响土壤化学性质如：土壤pH、NH₄⁺-N、NO₃^--N、C/N比和阳离子交换量进而影响细菌群落组成（图S3a）。同样，N₂O排放量与pH、NH₄⁺-N、NO₃^--N、C/N比和阳离子交换量显著相关（图S3b）。

图3. 不同处理的细菌群落组成。基于16S-rRNA基因的细菌群落的主成分分析（PCA）（a）。细菌群落的α-多样性指数（Chao1和Shannon）（b）。细菌门的相对丰度。“Other”表示丰度低于0.9%的类群（c）。不同处理OTUs相对丰度的聚类分析热图（d）。标尺的颜色对应不同OTU的相对丰度。相对丰度以该样本中某一分类的序列数除以所有序列的百分比计算。Control表示不添加对照，+N表示仅添加尿素，NB1，NB2和NB3表示不同比表面积的生物炭与尿素的组合。

5. 氮肥与生物炭添加对土壤硝化细菌群落组成的影响

不同SSA的生物炭影响了土壤中含有amoA基因的古细菌（AOA）的群落组成，而含有amoA的细菌（AOB）的群落组成没有显著变化（图S4）。仅添加尿素处理与生物炭处理的AOA群落明显不同，PCA1轴将生物炭SSA>2023 m² g⁻¹处理与生物炭SSA<2023 m²g⁻¹处理的AOA菌群落分开。但是，当生物炭SSA<2023m²g⁻¹时，PCA1和PCA2轴都不能成功区分AOA群落。

6. 土壤与生物炭中nosZ功能菌的优势OTU

功能菌nosZ在仅添加尿素与添加生物炭的处理之间有显著差异（图4a）。nosZ菌的主要OTU的相对丰度受不同SSA生物炭的影响（图4b）。最大SSA生物炭添加的土壤处理具有最高OTU5相对丰度（图4b）。利用荧光原位杂交技术（FISH）探寻OTU5在生物炭中的物理位置，我们发现OTU5丰度随着生物炭SSA的增加而增加，并且其在最大SSA的生物炭中最为明显（图4c中的红色区域）。

图4. 土壤中nosZ菌的群落组成及其在生物炭中的位置。土壤中nosZ细菌群落的主成分分析（PCA）（a）及该菌OTUs的相对丰度（b）。不同处理之间的统计学差异由小写字母表示（p<0.05）。Control表示不添加对照，+N表示仅添加尿素，NB1，NB2和NB3表示不同比表面积的生物炭与尿素的组合。FISH电镜图的红色区域展示不同比表面积生物炭上的OTU5，Post-B1-3表示B1-3经历56天培养后的生物炭样品（c）。

7. 生物炭中的细菌群落组成

培养56天后，我们从土壤中提取生物炭颗粒并通过16S-rRNA高通量测序研究其细菌群落（图S5）。PCA分析表明，不同SSA生物炭中的细菌群落组成显著不同（图S5a）。与土壤中类似，生物炭中最丰富的细菌门是变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）和WPS-2菌门（图S5b）。

8. 土壤与生物炭中氮循环功能菌的丰度

我们通过测定nosZ的基因拷贝数来确定N₂O还原菌的丰度（图5a）。结果显示，在前14天中，土壤nosZ的丰度随生物炭SSA的增加而增加，并且在最大SSA生物炭处理的土壤中最高。我们进一步计算了不同功能基因的比例以确定硝化和反硝化的主要功能基因。结果显示，在培养第5天，最大SSA生物炭处理的土壤中nosZ/(AOA-amoA+AOB-amoA)、nosZ/(nirK+nirS)、nosZ/(nirK+nirS+AOA-amoA+AOB-amoA)的比值最高（图5）。

在第14天和第56天，最大SSA生物炭处理的土壤中AOA和AOB的amoA基因的丰度最高（图S6）。在培养第7天后，nirK和nirS基因的丰度随生物炭添加而增大（第35天和第56天的nirS基因丰度除外）（图S6）。在整个培养期间（第14天除外），最大SSA生物炭处理的土壤中的nifH基因拷贝数最高（图S6）。

生物炭颗粒在培养56天后从土壤提取。qPCR结果表明，不同生物炭中的氮循环功能基因有所不同（图6）。随着生物炭SSA的增加（2773 m² g⁻¹以内），氮循环功能基因的数量增加（AOB-amoA基因除外）。

图5. 生物炭添加对nosZ丰度（a）、nosZ/(nirK+nirS)（b）、nosZ/(AOA-amoA+AOB-amoA)（c）和nosZ/(nirK+nirS+AOA-amoA+AOB-amoA)（d）的影响。误差线代表标准误差（n=3）。不同处理之间的统计学差异由小写字母表示（p<0.05）。Control表示不添加对照，+N表示仅添加尿素，NB1，NB2和NB3表示不同比表面积的生物炭与尿素的组合。

图6. 在不同比表面积生物炭中AOA-amoA（a）、AOB-amoA（b）、nirK（c）、nirS（d）、nosZ（e）和nifH（f）基因的丰度。Post-B1-3表示B1-3经历56天培养后的生物炭样品。不同处理之间的统计学差异由小写字母表示（p<0.05）。

9. 土壤与生物炭中N₂O排放与相关功能基因丰度的关系

生物炭中氮循环功能基因的丰度与其SSA，孔隙体积和孔隙直径呈正相关关系（图7a–c）。除了nirS基因，生物炭与土壤中AOA-amoA、AOB-amoA、nirK、nosZ和nifH基因的丰度呈正相关关系（图7d）。

回归分析表明，在土壤中，N₂O排放量与土壤中AOA-amoA和AOB-amoA基因丰度呈正相关（R²=0.24，p<0.05；R²=0.32，p<0.05）（图8a-b）；但是，随着nosZ/(AOA-amoA+AOB-amoA)、nosZ/(nirK+nirS)、nosZ/(nirK+nirS+AOA-amoA+AOB-amoA)的比值增加，N₂O排放量下降（图8c-e）。在生物炭中，随着nosZ丰度的增加，N₂O排放量下降（R²=0.50，p<0.05）（图8f）。

图7. 不同比表面积（a）、总孔体积（b）和总孔径（c）的生物炭中AOA-amoA、AOB-amoA、nirK、nirS、nosZ和nifH基因的丰度以及生物炭与土壤中这些基因的关系（d）。实线表示基于最小二乘法的线性回归计算的显著预测关系（p<0.05）。

图8. 回归分析展示了土壤N₂O通量与AOA-amoA拷贝数（a）、AOB-amoA拷贝数（b）、nosZ/(AOA-amoA+AOB-amoA)比值（c）、nosZ/(nirK+nirS)比值（d）、nosZ/(nirK+nirS+AOA-amoA+AOB-amoA)比值（e）的关系以及总N₂O通量与生物炭中nosZ基因的关系(E)。回归分析前对基因拷贝数做了对数转换。

生物炭增强了土壤的硝化作用并且最大SSA的生物炭减少了N₂O的排放。关于生物炭对N₂O排放的影响，在以往的研究没有得出统一的结论，比如：一些研究表明生物炭的添加会刺激N₂O的排放，也有一些则显示生物炭会抑制N₂O的排放，这说明生物炭对N₂O的影响机制比较复杂。我们的研究发现，N₂O排放通量在培养前14天内达到峰值，同时伴随土壤中NH₄⁺-N和NO₃^--N分别快速的减少和增加。土壤硝化作用将NH₄⁺-N转化为NO₃^--N，N₂O也是该过程的副产物之一，说明硝化作用是N₂O的主要来源。另外，添加生物炭的处理中AOA和AOB的amoA基因拷贝数显著高于仅添加尿素的处理，并且基因拷贝数与N₂O排放通量呈正相关关系（p<0.05）。这与不同生物炭或土壤条件下的野外和室内研究的结果一致，这些研究还显示：在生物炭的影响下，amoA基因是刺激土壤硝化过程以及N₂O的排放的关键。这些结果说明，与仅添加尿素相比，生物炭添加主要通过增加土壤中amoA基因拷贝数及氨氧化古菌丰度进而刺激N₂O的排放。

较大SSA的生物炭增加了nosZ基因拷贝数及其比例。所有反硝化菌中，有三分之一是nirS和nirK型，该微生物参与N₂O生成过程。另外，生物炭通过增加土壤N₂O还原菌（nosZ基因编码氧化亚氮还原酶）将N₂O转化为N₂进而减少N₂O排放，这是目前已知的环境中唯一还原N₂O的生物过程。我们的研究发现生物炭添加提高了土壤pH和nosZ基因数量，而低pH条件会抑制N₂O还原酶的合成组装过程。此外，研究进一步发现，生物炭添加主要通过提高土壤pH、NH₄⁺-N、NO₃^--N、C/N比和阳离子交换量进而改变细菌群落组成，比如增加氮循环相关的微生物的相对丰度，包括纤维杆菌、硝化螺旋杆菌、芽单胞菌、棒状杆菌、拟杆菌和变形菌。以往研究发现，纤维杆菌可以降解纤维素；硝化螺旋杆菌具有高硝化活性；芽单胞菌参与氮同化和异化过程的关键步骤；棒状杆菌参与次级代谢过程；拟杆菌和变形菌与土壤铵态氮含量呈正相关关系。因此，生物炭可以促进参与氮代谢循环相关微生物的生长。同样，N₂O通量与土壤pH、NH₄⁺-N、NO₃^--N、C/N比和阳离子交换量显著相关，表明生物炭还通过改变土壤化学性质、促进氧化亚氮还原菌的生长和活性，进而影响N₂O排放。N₂O排放量的降低与nosZ基因丰度的增加相关；生物炭SSA在最大时，nosZ/(nirK+nirS)比值也最大，表明高SSA的生物炭（>2023 m² g⁻¹）通过增加nosZ的丰度与比值而降低N₂O排放。

56天培养实验显示，定殖在生物炭中的细菌群落的组成受到生物炭的SSA的影响。这与Dai等人报道的生物炭中定殖的细菌群落受到其本身特性如pH、表面积和养分影响的结果一致。宏基因组学的一项研究鉴定出生物炭表面的一个生物基因簇，该基因簇包含一个脲酶操作子、脲酶转运基因、以及NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-的转运基因。随着生物炭SSA的增加（2773 m² g⁻¹以内），基因拷贝数如：AOA-amoA、nirK、nirS、nosZ和nifH基因也增加。生物炭的这种特性有助于其通过表面的众多官能团（羧基、羟基、内酯、色烯、酮类和氢键）吸附NH₄⁺和NO₃^-。此外，我们的结果证实，增加的生物炭SSA可以为微生物提供更多的生存空间。生物炭的孔隙可以充当硝化和反硝化微生物生态位（生存空间），从而为不同氮循环相关功能基因提供多种选择。选择的过程驱动了一系列微生物氮转化过程，最终导致N₂O排放。我们的结果支持以下假设，即定殖于生物炭的微生物的功能基因（如AOA-amoA、nirK、nirS、nosZ和nifH基因）的拷贝数随生物炭孔隙体积和直径的增加而增加，从而影响N₂O的排放。例如，在我们的研究中，随着生物炭SSA的增加，nosZ功能基因的丰度显着增加，同时导致N₂O排放减少。另一个潜在的机制是生物炭中amoA基因的丰度显著增加，促进异养微生物呼吸及氧气消耗，导致生物炭颗粒表面和内部局部厌氧；由于氧化亚氮还原酶比一氧化氮还原酶（生成氧化亚氮）对氧气更为敏感，缺氧环境刺激氧化亚氮还原微生物的生长和活性，进而导致完全反硝化与不完全反硝化的比率增加（更高比例的N₂O被还原生成N₂）。此外，生物炭还可以充当“电子穿梭器”，促进电子向土壤反硝化菌转移。生物炭SSA的增加还能增强其电子穿梭特性，也在一定程度上促进N₂O还原生成N₂。这些就是nosZ的丰度随着生物炭的SSA增加（2773 m² g⁻¹以内）而增加的原因。较大SSA的生物炭能促进土壤中nosZ基因丰度增加，进而导致N₂O排放减少。

较大SSA的生物炭通过增加nosZ的丰度从而减少土壤中N₂O的排放。本研究证实了我们的假设，即在生物炭上定殖的N₂O还原微生物是减少N₂O排放的关键因素。生物炭添加改变了土壤的性质，包括土壤pH、速效氮（NH₄⁺-N和NO₃^--N）、C/N比和阳离子交换量，从而影响细菌和N₂O还原菌的群落多样性、结构和功能。本研究利用FISH和qPCR技术，发现了氮循环功能微生物在生物炭上的定殖量以及土壤和生物炭中相关功能基因的数量随着SSA的增加而增加。生物炭添加的处理中，AOA和AOB的amoA基因丰度增加并与N₂O的排放量呈正相关关系，一定程度佐证了大SSA的生物炭（>2023 m² g⁻¹）通过增加nosZ的丰度与比值而降低N₂O排放。此外，随着生物炭SSA的增加，nosZ的丰度也显著增加，N₂O的排放减少，并且nosZ/(amoA+nirK+nirS)是在具有最大SSA的生物炭处理中最高。我们的研究对优化生物炭的制造以及缓解N₂O排放具有重要意义。在以后的研究中，应将生物炭的SSA和微生物在生物炭上定殖情况纳入考虑因素。然而，nosZ的低扩增效率是本研究的不足之一；因此，今后可以增加功能基因表达水平上的研究，如宏转录组学，或增加对功能基因转录子的定量研究。此外，本实验是基于短期的土壤微宇宙培养实验，没有考虑田间条件下植物-土壤-生物炭的相互作用。而在先前Castaldi等人的田间研究中，因添加生物炭导致土壤中物生物活性的提高作用被证明只是暂时的。因此，在未来需要进行长期的田间研究，以增进我们对生物炭中的微生物定殖情况及其对减缓N₂O排放作用的了解。