编译：萌依依，编辑：小菌菌、江舜尧。

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1 宏基因组鸟枪法测序早产患者（PTB）和足月分娩（FTB）对照者的阴道菌群：在研究期间成功招募了57名单胎妊娠，其中20名是低风险早产患者，37名是高危早产患者。我们的分析集中在怀孕中期每个妇女的单个样本(n=49)。其中，8例最终为早产(PTB)，其余41例为足月分娩(FTB)。

2 α多样性和β多样性分析

3 功能通路分析

1 分类分析

FTB和PTB组观察到的物种数量中位数分别为168种和185.5种(图1A)，对于Risk_PTB样本，观察到的最高物种数量为15种。在α多样性上，FTB组和PTB组之间没有显著差异(图1A)；但是，使用Shannon和Simpson指数，Risk_FTB组比No-risk_FTB组的多样性大(图1A)。在β多样性方面，Risk_PTB群落与No-Risk_FTB和Risk_FTB样本有显著不同(图1B)。

图1不同研究组之间的物种多样性。α-多样性比较，用香农和辛普森指数衡量，包括生产结果(A)或风险分组(B)的观察到的物种总数。经Wilcoxon‘s检验，差异有显著性*p<0.05或**p<0.02。由Bray-Curtis测量的物种水平群落差异，并使用PCoA对生产结果(C)或风险分组(D)进行可视化。

分类结果表明，乳酸菌在所有类群中占绝对优势，平均相对丰度为59.13%(图3)。由于样品间物种丰度和种类的差异很大，只有Lactobacillus crispatus(p<0.001)、Lactobacillus gasseri(p=0.028)和Bifidobacterium breve(p=0.036)在足月妊娠组和早产组之间存在显著差异。PTB样品与L.crispatus及L. gasseri呈显著负相关(p值分别为0.03和0.03)，经多次比较校正后，这些q值均小于0.25(图2C，表2和补充表2)。总体而言，使用GTDB数据库时，所有样品中BV(细菌性阴道病)伴生菌的优势度都很低。在所有样本中，最丰富的BV伴生种是B.vaginale和B.vaginale_G。然而，在FTB和PTB样本中，两者都没有显著增加(图2B)。B. vaginale_D、B.vaginale _E和B. vaginale_F与PTB样本有显著的相关性(图2C、表2和补充表2)。此外，F. vaginae和F. vaginae_A (本数据库将A. vaginae命名为F. vaginae)与PTB样本呈正相关(Q值分别为0.137和0.008；图2C，表2和补充表2)。

图2 各研究组的物种组成。A四个风险分组的所有样本中排名前30位的物种的相对丰度。B对所有样品中最丰富的十个物种的生产结果进行比较分析。采用学生t检验计算差异有统计学意义。C MaAsLiN分析关联物种多元数据固定效应。

将微生物种类分解成CSTs显示，所有拭子上都存在六种不同的CSTs(图3)。CST-8是由集群中最主要的物种确定的。CST-1以L.crispatus为主，总体上与分娩结局的相关性较弱 (补充表1；p=0.09)。来自Risk_PTB组的样本与CST-5之间的相关性很弱 (补充表1；p=0.09).对BV相关的CST-4有五个观察结果，其中三个来自Risk_PTB组。这一CST与Risk_PTB组样本呈正相关(p=0.02)。CST-3和CST-8均与妊娠结局无关。

图3 所有样本的群落状态类型。跨样本平均相对丰度>0.2的所有物种的相对热图强度比较，用皮尔逊聚类法对相似样本进行样本聚类。群落状态类型是基于每个样本中最丰富的物种来定义的，并由图的顶部条表示。

2 功能通路分析

在所有样本中共鉴定出2928个基因功能。将数据分层到细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MFS)这三个基因本体论分类中，揭示了风险分组之间的功能差异。与FTB相比，Shannon和Simpson多样性指数确定了PTB样本的BPs和代谢功能的基因功能多样性有显着增加(图4A)。当样本被分类到风险分组时，在Risk_FTB组和No-Risk_FTB组之间没有观察到这种功能差异(补充图1A)。通过Bray-Curtis测量，FTB和PTB样品在BP和MF类别中也在功能上彼此不同(图4B；p值分别为0.038和0.045)。从Adonis分析来看，只有L. gasseri显著影响所有三个类别的基因功能变异(p值分别为0.017 (MF)、0.027(CC) 和0.013 (BP))。采用多变量分析，22个CCS、154个BP和299个MFS与既往有PTB史、曾接受大环状切除术(LLETZ)、被归类为PTB风险类别或最终早产的女性显著相关(图5和补充表3；多重校正后Q值<0.25)。

图4 阴道微生物群的功能多样性。根据基因本体论分类，基因功能被划分为三个更高级别的功能类别，同时显示了识别内容的α-(A)和β-多样性(B)度量。根据Kruskal-Wallis的计算，p值小于0.05的星号突出了显著的差异。

对于与早产有显著关联的基因功能，MF类别包含了差异特征。其中包括与“2’ 3’-二磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶活性”，“受体活性”，“醛糖1差向异构酶活性”，“羧基或氨酰基转移酶活性”以及”铜输出ATP酶活性”相关的基因(图5和补充表3)。BP类中与早产最相关的五个基因功能包括“呼吸电子传递链”、“藻酸生物合成过程”、“ATP水解耦合质子运输”、“叶酸生物合成过程”和“葡萄糖分解代谢过程”(图5和补充表3)。

图5 多元关联分析。由MaAsLiN2(q值<0.25)确定的每个热图都显示了物种与类群的独立显著关联性。对于生物过程和分子功能，列出了排名前50位的功能。

综上所述，本研究利用鸟枪式元基因组学方法证实了由L. crispatus主导的阴道微生物群与足月妊娠之间的关联。这项研究还确定了随后早产的妇女阴道微生物群的功能差异。

到目前为止，为了解阴道群及其与PTB的关系已经进行了大量的微生物组测序研究。值得注意的是，BV已被确定为PTB的危险因素，但阴道球菌亚型的检测和区分可能很困难，可能会忽略细微的差异。

在我们的研究中，我们使用鸟枪元基因组学来确定PTB高危女性的阴道群落。与以前的方法相比，这种方法能够更高地分辨与高危妊娠相关的细菌种类。相对较高的微生物读取深度，加上最近更新的GTDB，揭示了低丰度(<5%；图3)的物种的丰富程度。

使用GTDB分类数据库，发现有几个B. vaginale与妊娠结局有不同的相关性(表2和图2C)。然而这些B. vaginale亚种并不占优势，平均相对丰度为14%。相反B.vaginale_D (9/49), B.vaginale_E (8/49)及B. vaginale_F (8/49)与PTB预后显著相关,其相对丰度从未超过0.2%。在如此低的丰度下，这些物种是否能在群中发挥有意义的生物学影响还有待确定。尽管如此，B. vaginale的组内差异突出了研究阴道健康和围产儿结局的关系时对该物种进行分层的重要性。另一种重要的BV 相关细菌--F.vaginae (A. vaginae)在3份PTB样本中被发现，丰度相对较高(4.42-8.10%)，但在足月样本中很少见，最高相对丰度为3% (3/41份样本)。这一物种已经被证明与B. vaginale形成了牢固的生物膜。以前的研究发现，这种物种的高负荷是PTB的危险因素。在我们的研究中有趣的是，在没有观察到PTB风险但早产的对照组样本中，F. vaginae的相对丰度增加(图3)。

羊膜梭菌(SneathiaAmnii)和普雷沃特氏菌(PrevoteaAmnii)最近被确定为不良妊娠结果的候选物种。在我们的研究中，这两项指标均升高，且与PTB有显著相关性(Q值分别为0.02和0.05；表2)。虽然BVAB-1(在GTDB中被指定为UBA629 sp005465875)在微生物组研究中被认为是阴道健康的一个潜在问题物种，但在本研究中没有确定该物种。然而，BV相关的CST，CST-4与PTB呈正相关，这一发现与以前的研究是一致的。

与以前的报告不同，我们没有看到早产和足月妊娠样本之间的α多样性有显著差异；然而，在L. crispatus和足月妊娠之间存在弱相关性，并且在来自足月妊娠的样本中，该物种的总体丰度增加了。这种联系与其他几项研究是一致的，即该物种是健康阴道微生物群的有益组成部分。综上所述，这些研究可能表明，L. crispatus在提供对PTB的保护方面发挥了作用。

在我们的早产儿队列中，涉及代谢功能和BP基因的功能图谱有明显的区别。除了嘌呤代谢外，PTB样本还具有更丰富的与蛋氨酸/同型半胱氨酸和叶酸代谢有关的功能。值得注意的是，孕妇的叶酸和同型半胱氨酸水平与包括PTB在内的不良妊娠结局有关。综上所述，从微生物代谢和宿主相互作用的角度来看，蛋氨酸/叶酸/半胱氨酸动态平衡的值得进一步研究。

虽然这些发现是值得反复研究的重要指征，但本研究数据集还是有局限性的。特别是，由于PTB的比例相对较低，需要更大的样本量来研究CST、物种和早产结局之间的联系。此外，这项研究的发现是针对高加索人群的，而种族此前被认为是研究阴道微生物群的主要混淆因素。

总体而言，这项研究证明了使用鸟枪式元基因组学来了解有PTB风险的妇女阴道微生物群的好处。早产相关阴道微生物群在分类学和功能潜力上的明显差异强化了微生物群在PTB中的作用。然而，这项研究和其他研究都无法确定严格的生物标志物，这突显了需要更大规模的对照研究，能够使用高分辨率的水平分析来排除其它混杂因素，如种族、生物地理和预先确定的风险因素的影响。本研究为研究菌群在自发性PTB中的功能作用提供了证据。

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