编译：傻狍子，编辑：木木夕、江舜尧。

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本次实从圣巴巴拉动物园的一只圣克莱门特岛山羊身上收集了新鲜排泄的粪球，这些粪球作为396个平行厌氧富集实验的原料。对样品进行培养及提取DNA并进行测序。原始序列文件可以在JGI基因组门户网站的JGI项目id 1140136、1132607、1149268和1149266中找到。将16S测序结果原始的正向和反向读取被USEARCH v.11中的' fastq_mergepairs '函数合并。合并后的reads修剪至291 bp，在R包DADA2 (v.1.8.0)中进行过滤。从22个样本的3,561,185个读数中的1,036,304,835个总碱基中获悉的错误用于dada2算法50的样本推断。去除嵌合序列后，从233个样品中得到8,171个16S-V4 ASV。使用针对DADA2 v.132版本格式化的SILVA分类学训练数据将分类法分配给ASV。对于18S测序结果，原始的正向和反向读取被USEARCH v.11中的“fastq_mergepairs”函数合并。合并后的reads修剪为421 bp，在R包DADA2 (v.1.8.0)中进行过滤，maxEE设置为1。从dada2算法推断2个样品中559,860个读数中从235,701,060个总碱基中获悉的错误用于样本推断。去除嵌合序列后，从165个样品中得到4,310个18S-V4 ASV。使用针对DADA2 v.132版本格式化的SILVA分类学训练数据将分类法分配给ASV。ITS2测序的原始读取被修整到ITS2区域，并使用ITSxpress v.1.8.0进行合并。由于基于ASV的分析流程对扩增子中的任何核苷酸变异都高度敏感，因此它可提供分辨率最高（菌株水平或更低）的微生物群落视图。为了在较高的分类学水平上提供山羊粪便微生物组和相关浓缩培养物的群落组成的观点，使用USEARCH55中实现的UPARSE-OTU算法将所有ASV的相似性阈值聚类为97％。将8171个16S-V4 ASV按97％的相似度进行聚类，产生了877个名为“ ASV_Clusters”的操作生物分类单位，该分类单位将样本中的原核生物群落划分为属和种之间。将4,310个18S-V4 ASV按97％的相似度进行聚类，产生了24个名为“ ASV_Clusters”的操作生物分类单位，这将我们样本中的真核生物群落划分为属和种之间。将2093个ITS2 ASV按97％的相似度进行聚类，产生了647个名为“ ASV_Clusters”的操作分类单位，这将样本中的真菌群落划分为属和种之间的水平。每个样本的Alpha多样性用ASV_Clusters的数量来表示。为了评估beta多样性，使用R包phyloseq v.1.8.0实现UniFrac距离度量进行非度量多维尺度缩放，。我们进行了排列多变量方差分析，以检验假设，即无论底物类型如何，在G10处无抗生素的群落组成是相同的。

在JGI使用BBMap软件包(v.38.00)中的BBDuk工具对宏基因组读段进行质量过滤，使用Trimmomatic对读段进行额外的质量过滤。使用SPAdes 3.11.1进行宏基因组组装，长度分别为21、33、55、77、99和127。使用默认设置的bowtie2进行读图，使用MetaBat2进行无监督的基因组装箱，使用CheckkM评估原核杂志的质量。汇总所有MAG，然后使用参数“ -comp 80 -con 10–S_algorithm gANI -sa 0.965 -nc 0.6”使用dRep进行重复复制，从而在物种水平上复制基因组区域，从而获得719 MAG。先前的研究使用99％的平均核苷酸同一性阈值从牛瘤胃中重建了913个MAG，但在本研究中用于定义MAG的物种水平阈值下，独特的牛瘤胃MAG的数量仅为627个。从富集菌群中重建了大约18个MAG，其大小> 40 Mbp，被命名为“eukMAGs”，因为elastMAGs中80％以上的基因被BLAST +分类为“真核生物”。通过使用BUSCO工具将通用单拷贝直向同源物的数量与真菌界常见的直向同源物的数量进行基准比较，估计了eukMAG的完整性。通过使用dRep与分离的厌氧真菌基因组进行全基因组平均核苷酸比较，并基于60％的eukMAG中存在的60个单拷贝直向同源物构建系统树，来确定eukMAG的分类。使用PhyloPhlAn构建了包括所有MAG和eukMAG的系统发育树，并使用生物交互树对带有酶计数的树进行了可视化。利用IMG/M进行功能注释，MAGs的酶基因是通过其蛋白家族(Pfam)结构域鉴定的。根据碳水化合物活性酶数据库将注释为GH和PL的基因分为三类:纤维素酶(GH5、GH6 GH7, GH8, GH9, GH12, GH44, GH45, GH48, GH51, GH74和GH124),半纤维素酶(GH5、GH8 GH10, GH11, GH16, GH26, GH30, GH43, GH44, GH51, GH62, GH98和GH141)和果胶酶/酯酶(GH28、PL1、PL2 PL3, PL9, PL10, CE1, CE2, CE3, CE4, CE5, CE6, CE7, CE8, CE12, CE15和CE13)。酶的存在决定了每个MAG的水解能力。利用R包ggplot2生成了比较MAG和eukmas和不同抗生素处理之间不同家族酶数量的箱形图。采用方差分析(ANOVA)来检验MAGs和eukMAGs以及不同抗生素处理之间每个家族内的酶数相同的假设。执行Dunn的测试来进行两两比较，并使用R包rcompanion生成一个总结结果的表。最后在打开CGC-Finder的情况下使用dbCAN2独立工具搜索了CGC。CGC-Finder将CGC定义为包含至少一个CAZyme基因，一个转运蛋白基因（针对转运蛋白分类数据库分类）和一个转录因子基因（针对数据库CollecTF，RegulonDB和DBTBS分类）的基因组区域。在所有CGC中，特别令人关注的是在拟杆菌属中发现的PULs和在革兰氏阳性细菌中常见的含有至少一种ABC转运蛋白的CGC。通过搜索工具PULpy所实现的SusC/D对的存在来识别PUL。通过搜索主要的Pfam PF00005以及以下与ABC转运蛋白相关的家族来鉴定含有ABC转运蛋白的CGCs：PF00950，PF03109，PF01061，PF12679，PF12698，PF12730，PF13346，PF06182，PF00664，PF06472，PF13748，PF04392 ，PF06541，PF14510和PF16949。

1. 山羊粪便宏基因组包括未培养的细菌和古细菌

超过1.5 Tbp的宏基因组测序能够从山羊粪便中回收2452个高质量的细菌和古菌MAG。其中，根据最近提出的物种定义标准(图1)，719种微生物在物种水平上是独一无二的。MAGs在规模和质量上与之前发表的其他厌氧微生物群落相似。我们对开放阅读框的全基因组平均核苷酸同源性进行了比较分析，并对当前研究中MAGs贡献的系统发育多样性的增加进行了量化。与3个最大的反刍动物肠道宏基因组数据集的8178个基因组相比，细菌和古菌基因组百科全书(GEBA)收集、最近的人类肠道细菌收集11和来自国家生物技术信息中心(NCBI) RefSeq的221个额外参考基因组，在本数据集的719个MAGs中，有677个(94%)之前在物种水平上未被确认。本研究提供的MAG集合强调了在食草动物中进行前肠和后肠发酵的肠道微生物的巨大未开发代谢潜力。

图1山羊粪便宏基因组中细菌、古细菌和真菌的系统进化树。通过系统发育树将原核MAGs分为51组（在外环中着色）。系统发育树是从一棵树上确定的，包括来自Hungate收集，牛瘤胃，GEBA和人类肠道收集的8,178个参考基因组，以及来自NCBI收集的221个其他参考基因组。以对数标度绘制的彩色条表示在每个MAG / eukMAG中发现的CAZymes（包括纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶/酯酶）的数量。从树梢放射出的蓝绿色条表示在实验结束时（G10）至少一种富集培养物中存在的MAG。

尽管最近的许多研究已使用宏基因组学来评估草食动物瘤胃内的代谢潜能和相互作用，但对草食动物后肠的关注较少。位于后肠的微生物通常起源于瘤胃并在瘤胃中活跃，但它们也会遇到在前肠中未被完全加工的顽固植物物质。此外，事实证明，直接从瘤胃中培养的肠道微生物（通过有瘘的动物）在培养中很难稳定，这可能是由于严格的营养或生理要求，而这些要求很难在瘤胃外部进行模拟。因此，假设粪便中的肠道微生物富集培养物在培养中会更健壮和更有弹性，因为这些微生物会经历广泛的生物学，化学和物理条件。组装的MAG中有四分之三（531）是厚壁菌门,并且其中一半以上属于Ruminococcaceae科,除了Ruminococcus属以外，大多数以前未被鉴定且未在培养物中富集（图1)。第二个最丰富的杂志是拟杆菌门中门(12%)(85),MAG中第二丰富的门（12％）是拟杆菌（Bacteroidetes）（85），其中最丰富的组属于Rikenellaceae科。此外，还回收了25种古细菌MAG，其中Methanobrevibacter sp.是最丰富的。其余的原核MAG分别来自变形菌门(23)、慢藻门(21)、放线菌门(10)、疣微菌门(8)、蓝藻门(7)、螺旋体门(6)、普朗克菌门(2)和迷踪菌门(1)。

2. 从山羊粪便宏基因组重组真菌MAGs

用与原核MAGs相同的组装和装箱管道回收了18个>40Mbp大小的MAGs。它们被称为“eukMAGs”，因为eukMAGs中80%的基因被BLAST+归类为“真核生物”。由于真核生物的基因组通常为>10Mbp，且具有长且频繁的低GC含量重复区，因此恢复真核生物的基因组尤其具有挑战性。本研究将所有eukMAGs归入真菌亚门，俗称厌氧肠道真菌。基于单拷贝同源性的系统发育分析表明，eukMAGs中有12株属于Neocallimastix属，可能与先前从山羊粪便中分离到的Neocallimastix californiae G1为同一种。使用通用单拷贝直系同源物(BUSCO)工具对通用单拷贝直系同源物的数量进行基准测试，从而估计eukMAGs的完整性。与相应的参考基因组相比，我们的eukMAGs平均有73%是完整的，有14%的重复BUSCOs。从富集培养物中读取的宏基因组大部分可以通过映射到MAGs和eukMAGs来解释。迄今为止，由于厌氧真菌是消化道微生物组中典型的低丰度成员，所以之前的MAG数据集没有识别厌氧真菌，但最近发现它们含有丰富的生物量降解酶和多酶纤维素体。本研究收集了山羊粪便微生物组的细菌、古菌和eukMAGs，为肠道微生物组的宏基因组学研究提供了丰富的资源，包括瘤胃微生物组或其他未发表的微生物分类。

3. 山羊肠道微生物群中生物量降解酶的丰度

根据CAZy数据库（图1），对带注释的原核MAG和eukMAG的碳水化合物活性酶（CAZymes）的含量和多样性进行了分析，这些酶属于纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶/酯酶的功能类别。值得注意的是，糖苷水解酶(GH)家族GH5、GH8、GH44和GH51功能多样，可以水解纤维素和半纤维素，这取决于特定的亚家族。每个基因组中，由eukMAGs代表的Neocallimastix属的厌氧真菌最多包含100种以上的每种CAZyme，仅在经过抗生素处理（青霉素-链霉素（PS）或氯霉素（CM））和培养的聚生体中富集。在原核MAG中，含酶最多的类群为瘤胃球菌属、丁酸弧菌属和普氏菌属厌氧细菌，以及类芽孢杆菌科、拟杆菌科和瘤胃球菌科厌氧细菌。这些类群富含在木质纤维素上生长的无抗生素菌群，通常每MAG包含5种以上的纤维素酶和10多种半纤维素酶和果胶酶/酯酶。

与普雷伏菌属、丁酸弧菌属和瘤胃球菌属的平均MAG相比，平均MAG中木质纤维素活性基因的数量要高一个数量级，表明新麦丝菌门具有巨大的水解潜力。主要的细菌纤维素酶包括GH5和GH9，以及一种GH44独特的细菌MAGs。主要来源于真菌的纤维素酶有GH5、GH6、GH9、GH45和GH48，其中GH6和GH45仅在eukMAGs中存在。酶GH48和GH6是众所周知的真菌纤维素体中丰富的蛋白质。半纤维素酶，常见的两种MAGs和eukMAGs，包括GH5, GH10, GH11, GH26和GH43。较少发现的酶GH62和GH98仅限于细菌MAGs。这是食草动物消化道厌氧真菌和细菌催化酶功能互补的证据。值得注意的是，厌氧细菌瘤胃球菌和梭状芽胞杆菌的Neocallimastix eukMAGs和MAGs也含有dockerin相关的酶，表明有可能产生纤维素体。厌氧环境中的纤维素体是由所有已知厌氧真菌和选择厌氧细菌部署的多酶复合物，它通过酶在柔性蛋白支架上的捆绑和重排来协助木质纤维素的协同分解。

4. 宏条形码揭示了富集过程中社区的快速稳定

从大型食草动物中培养出各种厌氧肠菌群已被证明是异常困难的。在本研究中，源消化道微生物组（山羊粪便）受到四种不同碳底物和两种化学处理的处理，目的是选择性富集能够在实验室培养中保持活力的种群成员。36组菌群被富集，每个菌群连续培养10次，重复培养3次（图2）。基于扩增子序列变异（ASV）的标记基因分析跟踪了原核生物和真核生物的群落组成，到第三代几乎都稳定下来。一小部分来源的粪便微生物群(0 ~ 2.2%)在这些培养物中富集。

图2富集策略。富集策略来表征跨域厌氧木质纤维素分解菌群(a)和富集菌群的微生物组成(b)。新鲜产自圣克莱门特岛山羊的粪球作为396个平行微生物富集实验的源微生物组。通过四种基质和两种抗生素处理来启动富集培养，以研究不同微生物群落的生存。每种条件接种三次培养。用青霉素-链霉素(PS)抑制细菌生长，用氯霉素(CM)同时抑制细菌和古生菌生长。通过宏条形码和全宏基因组组件(G0、G5和G10)跟踪平行富集的成员，并在每一代完成顶空和液体培养的代谢组学分析。利用16S rRNA V4区和ITS2基因的代谢编码对源微生物和富集实验结束时菌群的原核和真菌群落组成进行了评估。在16S rRNA群落组成饼图中，每种颜色代表一个门，同一门的每个切片代表不同的科。在ITS2群落组成饼图中，每种颜色代表一个属，同一属内的每个切片代表一个以97%身份阈值分组的ASV群集。

与厌氧消化器中观察到的微生物群落稳定时间相比，这些丰富的微生物群落的稳定时间非常短，厌氧消化器中传统上采用较长时间的选择方法来塑造群落成员。PS处理的菌群抑制细菌生长使厌氧真菌和产甲烷古菌成为群落的优势成员。特定于Methanobrevicacter属的古菌在源接种物中的丰度高达177倍。基于16S核糖体RNA V4区域的群落组成表明，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度相似，共同占源微生物组的90%左右(图2b)。通过内部转录间隔区2 (ITS2)鉴定的源微生物的真菌成员主要包括来自Piromyces属(41%)、Caecomyces属(26%)和Neocallimastix属(12%)的厌氧真菌(图2b)。山羊粪便微生物组的原核菌群与奶牛粪便微生物组的原核菌群具有相似性，均主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)组成，其中包括普氏菌门(Prevotella)和拟杆菌门(Bacteroides spp.)，以及许多未分类的拟杆菌门(Bacteroidales)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和毛螺旋菌科。然而，在富集培养中，基质类型在形成群落组成中起着重要作用。例如，由G3，链球菌，Butyrivibrio和Pseudobutyrivibrio spp。以及来自Ruminococcaceae和Lachnospiraceae的其他类群在三个木质纤维素底物上生长的无抗生素群落占主导地位。相比之下，月单胞菌和肠球菌占木聚糖无抗生素生长菌团的80%。

丹毒杆菌科和瘤胃球菌科在PS处理中具有较高的丰度，表明这些细菌谱系对PS产生了抗性。然而，这两个科都不存在于CM处理的群落中，其中一些CM耐药细菌来自放线菌纲和杆菌纲。基于ITS2的分析表明，G3 Neocallimastixsp菌群主要在木质纤维素为基质的抗生素处理(PS或CM)生长，而Caecomyces菌群主要在木聚糖为基质的抗生素处理(PS或CM)生长为主。具有不同根状形态的真菌的差异富集可能是底物的功能，可能表明厌氧真菌的功能专一化。例如，Neocallimastix sp.生长了一个广泛的根状网络，使这些真菌能够穿透复杂的木质纤维素基质，而Caecomyces sp.缺乏根状组织可能会促使其偏好可溶性基质。通过不同的底物类型和抗生素处理方法选择的这些独特的微生物群落，证明了我们丰富富集专门从事生物质降解的来源微生物组低丰度成员的方法的高效性。

5.绘制生物质分解的代谢潜力图

719个MAG和18个eukMAG的重建和注释使得能够在物种水平上估计微生物群落成员的代谢潜能。这有助于破译在木质纤维素分解和发酵过程中群落成员之间的功能区划和冗余。每个MAG的利用或生产化学品的能力是通过包括至少75％完整的相应代谢途径来确定的（图3）。代谢组学对主要代谢产物的定量提供了重构代谢的验证，并对每个浓缩组团的性能进行了基准测试。基于MAG的分析表明，在富集过程中，所使用的底物会严重影响群落群落成员。例如，在生长于最富木质素的底物蔗渣上的无抗生素联合体中，来自唇螺旋藻科的两种细菌高度富集，而在苜蓿上生长的无抗生素菌群中则不存在它们。相反，在苜蓿和金丝雀草无抗生素菌群中，同一家族不同菌群(Lac1)的相对丰度是甘蔗渣无抗生素菌群的40-65倍。利用甲醇的古细菌Thermoplasmata和施氏甲烷菌仅富集在苜蓿上生长的无抗生素菌群中，而苜蓿的果胶含量最高，果胶的主要降解产物是甲醇，这可能解释了这些类群在苜蓿上的富集。总体而言，这些数据表明底物类型会选择相应的微生物，以解聚相应的碳底物，并利用增溶的产物进行发酵和甲烷生成。

图3富氧厌氧菌群中微生物之间的交叉进料。每个形状都包含一个数字或字母，每个形状包含一个数字或字母，代表一个MAG在G10中对整个社区的贡献为>1%。每种形状对应于碳基材的类型。三角形代表苜蓿的茎；正方形代表蔗渣;圆圈代表芦苇金丝雀草；钻石代表木聚糖。连接线的粗细与相应群落中所连接的MAG的相对微生物丰度成比例。如果负责代谢物利用或生产的途径在重建的MAG中至少完成了75％，则在MAG和代谢物之间连接一条线。MAG和纤维素、半纤维素或果胶之间的连接线至少需要两种纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶/酯酶。MAG的编号或字母为：1，厌氧弧菌属；2，拟杆菌属；3，丁酸弧菌属.；4，耳蜗梭状芽胞杆菌；5，肠杆菌科；6和7，大肠杆菌；8，粪肠球菌；9-11，韦荣球菌科；12，唇形科G11; 13，斜纹科JC7; 14，梭状芽孢杆菌。15–19，斜纹藻科；20，拟南芥杆菌; 21，米氏甲烷弧菌；22和23，小球藻；24，假丁酸弧菌。AR14; 25，假单胞菌；26，阿鲁米球菌；27，黄褐变球菌；28，瘤胃菌科; 29，硒单胞菌；30，马链球菌；31，解脲链球菌；32，热原体纲；33，密螺旋体属；N，Neocallimastix sp；P，Piromyces sp；C，Caecomyces sp。

6.以真菌为主导的群落产生更多的甲烷

以细菌群落为主导的群落的特点是潜在的生物降解策略不同于那些在真菌为主的发酵单糖的特点(图3)。与群落中较丰富的成员相比，一些稀有MAG（相对丰度<1％）具有独特的代谢潜能。例如，Rum17仅占富集木聚糖菌群(XG10R1)的0.5%，但这是该菌群中唯一具有几乎完全丁酸盐生产途径的MAG，这解释了该样本中测定的丁酸积累的来源(图4)。在无抗生素菌团中，来自不同门的纤维素分解菌和发酵菌团存在高度的功能冗余，而厌氧真菌主导了抗生素处理的菌团成员，其中碳未被细菌转移以产生丙酸盐和丁酸盐，结果PS处理后的群落产生了最高量的甲烷。

图4平行富集期间主要代谢产物的净变化。将测量结果按抗生素处理和用于驱动富集的碳底物类型进行分组。每个子组下的三个条形表示在G0（0），G5（5）和G10（10）进行的测量。基质包括苜蓿茎（A），甘蔗渣（B），金丝雀草（R）和木聚糖（X）。每个条形代表三个生物学重复的平均值。

当在苜蓿上生长时，PS群落产生的甲烷几乎是不含抗生素的群落的甲烷的两倍（图5）。在紫花苜蓿或芦苇金丝雀草上生长时，在PS选择的群落中观察到很少的氢积累，而在无抗生素的群落中发生了少量的氢积累，这表明PS群落中的代谢产物交换效率高于无抗生素联合体。正如预期的那样，由于存在厌氧真菌和不存在产甲烷菌，经CM处理的群落（以真菌为主导）不会产生甲烷，但会产生氢（图5）。产甲烷菌使用氢并产生甲烷，这解释了PS群落和CM群落之间不同的代谢产物。在PS群落中发现了7个Firmicutes MAG，其中Erysipelotrichaceae科是其中最丰富的。这些抗PS的Firmicutes可以利用己糖，同时生产甲酸盐，乙酸盐和乳酸盐。因此，它们可能有助于通过保持一致的，但较低水平的单糖来防止厌氧真菌的分解代谢物抑制。

图5在G1、G3和G10富集培养苜蓿茎上累积产生氢和甲烷。a-c，右侧显示从G1开始培养的照片。a，无抗生素培养的结果。混浊的液体介质是细菌生长的特征。b, ps处理的培养结果。c, cm处理培养物的结果。符号代表平均值(n = 3)，误差线代表标准差。在抗生素处理的培养基中，透明的液体培养基表明原核丰度较低。漂浮在液体培养基中的成簇的苜蓿茎是厌氧真菌生长的特征，因为真菌直接与底物结合，通常由于残留的发酵气体而漂浮。

7.无抗生素菌群在功能上表现出高度的功能冗余

在无抗生素菌群中，富集的细菌可能占据混合营养级，具有降解植物细胞壁和发酵单糖的双重能力。结果是，这些菌群表现出高度的功能冗余，有44个细菌能够水解，78个细菌能够发酵。瘤胃球菌属、普氏菌属、丁酸弧菌属和假丁酸弧菌属以及毛螺旋菌科富含纤维素分解菌和半纤维素分解菌。这些细菌大多能产生甲酸盐、乙酸盐和乳酸盐(图3)，这是典型的肠道微生物群落。尽管只有不到一半的微生物群落可以产生丁酸，而只有不到20%的微生物群落可以产生丙酸，但丁酸和丙酸的生产潜力在变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门4个细菌门上重复分布。木聚糖培养的无抗生素菌群以反刍月单胞菌为主，另一种细菌粪肠球菌也富集。与复合纤维相比，木聚糖培养基中有大量的还原糖，这可能是观察到的微生物多样性极低的原因。无抗生素菌群中甲烷产量的中等水平以及丙酸和丁酸的高产量清楚地表明碳流转向了短链脂肪酸而远离甲烷。

8.真菌与甲烷原的伙伴关系使纤维素降解

反刍动物微生物区系中调节木质纤维素降解和甲烷生成的因素尚不清楚，这进一步促进了草食动物微生物区系的表征。当在纤维素纸(Whatman滤纸)上生长时，富集在苜蓿上的PS菌群在生长7天后降解的底物几乎是富集在金丝雀草上的无抗生素菌群的两倍(图6a)。当在纤维素纸上生长时，过量的还原糖从PS组释放出来，而不含抗生素组却没有释放出来(图6b)。相比之下，PS菌群和无抗生素菌群在生长7天后降解了同等数量的金丝雀草(图6a)。这表明，尽管真菌为主的菌团在降解纤维素方面比细菌为主的菌团有优势，但这些优势并没有导致粗的、富含木质素的底物解聚增加。

图6真菌酶和纤维素体驱动由厌氧真菌和产甲烷古菌主导的群落的木质纤维素效率。

a,b，底物消耗的部分(a)和还原糖的释放(b)，在纤维素纸和金丝雀草上生长的富集培养物。a和b中的每个条代表三次重复的平均值，误差条代表s.d.(n = 3);“不含抗生素”的菌群最初是在金丝雀草上选择的，而“PS” 菌群最初是在苜蓿上选择的——两者都是经过长期传代、低温保存和在实验前解冻的。c，从G5和G10开始的所有富集培养物中，分类为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶或酯酶的酶的数量，其区别在于是否存在与酶融合的细菌或真菌dockerin结构域。注意，y轴被划分为三个不同的尺度。红色框代表与dockerin(s)相关的细菌酶，带有黑色斜条纹的绿色框代表与dockerin(s)相关的真菌酶，黑色点状图案代表与dockerin(s)不相关的酶。大写字母代表基质类型:苜蓿茎(A)，甘蔗渣(B)，金丝雀草(R)和木聚糖(X)。“PS” 菌群消耗纤维素纸的比例显著高于“无抗生素”菌群(双尾Student’s t检验，P = 0.017)。配对Student’s t检验显示，在植物基质上生长的PS或CM菌群中带有真菌dockerin的CAZymes的数量（n = 6）显着高于无抗生素菌群中带有细菌dockerin的CAZymes的数量。配对的学生t检验还显示，PS或CM菌群中CAZymes的总数显着低于无抗生素的菌群。

通过列举每个群落中有和没有dockerin域关联的纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶和酯酶的数量，比较了真菌主导的PS群落和细菌主导的无抗生素群落所采用的木质纤维素水解策略。我们发现，在木质纤维素底物上生长的PS群落中的纤维素CAZymes的数量比无抗生素群落中发现的要高两个数量级，这表明纤维素体是真菌主导的群落采用的关键生物量降解策略（图6c）。相比之下，在各种木质纤维素底物上生长的无抗生素群落中的纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶和酯酶的总数高于PS群落中的纤维素酶（图6c）。与PS组相比，在无抗生素联合体中观察到的CAZymes数量更多是由于大量的GH5，GH8，GH9，GH16，GH26，GH30，GH43，GH28，碳水化合物酯酶CE4和CE8引起的。尽管如此，GH6和GH45（纤维素酶）仅在PS群落中富集，与无抗生素群落相比，PS群落中的GH48，GH11和多糖裂解酶3（PL3）数量更多。另外，在富含无抗生素的群落的MAG中，平均存在约8个CAZyme基因簇（CGC），其由至少一种CAZyme基因，一种转运蛋白基因和一种转录因子基因的存在定义。在富含无植物成分的无抗生素菌群的拟杆菌属MAGs中，平均有17–22.5个多糖利用位点（PUL），由串联存在的SusC和SusD基因定义。

此外还进行了一些实验，以确定性能最佳的木质纤维素分解组合生产甲烷的长期稳定性。这个群落在实验室维护>3年而持续生产甲烷。真核群落的成员是一个厌氧真菌属Neocallimastix,而优势细菌成员则来自紫锥菊科。瘤胃球菌的丰度较低，而甲烷短杆菌是甲烷生成的主要原因。此外，该菌团的原核和真核部分在−80℃低温保存1年以上后都是稳定的。重要的是，该菌团在低温保存恢复后产生了甲烷，表明其在木质纤维素生物加工应用方面的长期潜力。

我们报道了约400个平行微生物富集实验，为肠道微生物之间的代谢连接提供了有价值的见解，并为木质纤维素分解和生物产物生成的微生物群落设计提供了参考。不同抗生素和底物的差异富集使我们能够将山羊肠道微生物组分解为特定的类群，并允许分析以细菌或真菌为主的复杂微生物群落。宏基因组学和代谢组学分析表明，细菌主导的群落和真菌主导的群落都能产生甲烷，但我们发现真菌主导的群落产生的甲烷是细菌主导的群落的两倍，降解的纤维素是细菌主导的群落的两倍。

宏基因组的比较分析表明，微生物群落的代谢潜力在决定木质纤维素生物质解构和发酵的结果中起着基本作用。细菌以无抗生素菌群为主，而不常见的瘤胃微生物组成员仅在PS或CM的帮助下培养。在无抗生素菌群中，来自Lachnospiracea家族和Bacteroidales目的少数优势成员，除了甲酸盐和氢之外，还发酵了大量的水解碳，形成丙酸盐和丁酸盐。碳向短链脂肪酸转移降低了氢营养产甲烷菌的底物可用性，这与之前在瘤胃微生物学中报道的代谢动力学是一致的。相反，由于厌氧真菌不能产生丁酸和丙酸，所以在PS群落中甲烷的产生水平要高得多。总之，这些观察结果表明，简单的培养工具可以用于将微生物群落的产出转移到目标产品上。例如，如果设计的联合体的目标是生产甲烷，那么联合体应该通过排除产生丁酸和丙酸的细菌来简化产甲烷的发酵产品。

高水平的宏基因组学也使山羊肠道微生物组中数千种酶的鉴定成为可能。与不使用抗生素的群落相比，使用抗生素的群落降解了更多的纤维素，尽管后者检测到的总酶数更高。虽然我们在本研究中没有比较相对转录水平或表达蛋白，但值得注意的是，相对于无抗生素群落，PS群落编码了大量的dockerin相关的酶基因，这些基因通常被认为是酶栓系系统的一部分。与单纯依靠游离酶作用的微生物团相比，酶的自由扩散和酶栓系(纤维素体)系统之间的协同作用可导致更多的纤维素分解，这在以前已有报道。此外，抗生素处理的菌群允许真菌存活，它们的根状网络能够穿透粗木质纤维素，暴露植物聚合物的表面供游离和纤维素体酶作用。这些发现强调了厌氧真菌等稀有微生物在木质纤维素生物量降解中所起的重要作用，尽管真菌的丰度比瘤胃肠道细菌低几个数量级。

通过对四种不同碳源的微生物群落进行比较，我们发现基质组成在形成微生物群落组成中起着至关重要的作用。具体来说，在不含抗生素的富集培养中，简单还原糖富集了少数主导群落的专业发酵菌，而复杂的木质纤维素底物富集了许多功能冗余的木质纤维素分解菌。同样，在粗植物材料上富集的抗生素处理培养可能是为能够形成根状体的厌氧真菌而选择的。另一方面，球茎真菌在富含木聚糖的抗生素处理培养物中占优势，这表明它们比丝状厌氧真菌更擅长使用还原糖作为碳底物。在群落复杂性方面，本研究中富集的PS群落由较少的成员组成，而无抗生素的群落包括更高数量级的细菌类群，这给它们在生物质转化中的应用提出了工程上的挑战。限制群落成员的数量可以简化代谢模型的构建，而且较不复杂的群落更容易在工业条件下进行扩展和测试。这种简单的群落易于冷冻保存以及保持群落稳定性，进一步提高了该群落的工业实用性。

对山羊粪便微生物组的深入分析，以及我们的浓缩培养，为有兴趣设计木质纤维素生物质转化为富含甲烷的产品或其他目标的工艺的生物技术界提供了丰富的资源。此外，我们的研究结果表明，尽管已观察到瘤胃中这些微生物的共存，但将厌氧真菌与快速生长的纤维素分解和发酵细菌共同培养仍然是一项挑战。为了设计厌氧真菌和细菌的群落，至关重要的是，更好地了解使厌氧性真菌作为食草动物肠道中的稳定成员而持续存在甚至成长的理化参数。

我们对选择性干预如何调整肠道菌群的成员和化学输出的评估提供了一个知识基础，可以通过设计最小的系统或合成菌群，来将木质纤维素生物转化为有附加值的化学品。

作者对山羊粪便微生物组进行了大量的分析，通过四种基质和两种抗生素处理，来确定底物和抗生素如何影响草食动物肠道群落的成员，活性，稳定性和化学生产率。并通过宏基因组方面的研究，探讨了山羊肠道微生物群中生物量降解酶的丰度。通过大量的实验及可靠的结果，为木质纤维素分解的研究和为更好的生成有价值的生物产物的微生物群落设计提供了参考。

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