编译：厚朴，编辑：木木夕、江舜尧。

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本研究的实验地位于加拿大的北方森林（56.1^◦N, 110.9^◦W）。N和S沉降实验开始于2006年7月。实验地包括4个区组，每个区组包括4个处理，分别是：对照（CK），N添加（+N，30 kg N ha^-1 yr^-1, NH₄NO₃），S添加（+S, 30 kg S ha^-1 yr^-1, Na₂SO₄），以及N和S联合添加（+NS, 30 kg N ha^-1yr^-1, 30 kg S ha^-1 yr^-1）。在2016年7月在每个样方中采集了有机层（7-8 cm 深度）和无机层（0-15 cm）的土壤。有机层的土壤过4-mm筛，无机层土壤过2-mm筛。细根从鲜土中收集用于测定根相关联的真菌群落，细根的子样品用去离子水仔细的冲刷表面的土壤颗粒，用吸水纸吸干，4℃状态下储存，用于真菌丰度的测量以及DNA的提取。为了测定总的根相关真菌的丰度，我们提取了氨基糖（用来代表总的真菌生物量）。

1 ITS序列和功能群分类

我们获得了1,531,001条高质量的序列，其中899,564条（58.8%）序列属于真菌。对每个样品抽平到9457条序列，每个样品平均包含320（±20）真菌分类单元（OTU）。我们的数据包含6个门，18个纲，63个目，127个科和272个属。最占优势的门是担子菌门（稀释后相对丰度是59%），其次是子囊菌门（37.8%）。FUNGuild对1231个真菌OTUs进行了功能的分配，占总的真菌OTUs的61.4%，然而936个真菌OTUs（占总的真菌OTUs的46.7%）被指定的功能的置信水平为“可能”或者“很有可能”。

在一个逐渐降低的目中，通过FUNGuild定义的生态类群的相对丰度是（图S3b）：EMF（占总的真菌读数的44.1%）>腐生真菌（16.3%）>DSEs（9.4%）>未分配的（9.5%）>病原/腐生（8.4%）>腐生/共生（5%）>病原/腐生/共生（3%）>病原/共生（1.9%）>ERM（1.7%），其它真菌丰度的平均值占比<1%。植物病原菌序列占0.3%的相对丰度，而AMF占0.09%。

在植物病原菌的分类群中，最丰富的三个科是Nectiaceae, Sclerotiniaceae和Dermateaceae。在EMF分类群中，有三个最占优势的科是Cortinariceae, Russulaceae 和Atheliaceae。在DSEs中最丰富的科是Vibrisseaceae, Herpotrichiellaceae 和Coniochaetaceae，然而最多的属没有分配到特定的科。在ERM中，只有一个科，Myxotrichaceae，和一个属，Oidiodendron，被发现。在AMF中，Glomeraceae是最丰富的科，并且在我们的样品中大多数序列都能定义到属水平。

N敏感的，N耐受的以及混合响应的EMF属的序列分别占总的EMF序列的59.7%，1.6%和31.6%没有被分配的EMF序列和对N没有响应的EMF序列分别占总的EMF序列的2%和4.1%。

2 病原菌多样性的变化

N或者S添加没有改变根相关联的真菌总的丰度或者根相关联的植物病原菌的相对丰度和物种丰富度。此外，在森林有机层土壤中，N添加增加了植物病原菌的香浓多样性（基于OTU水平）（图1a和b）以及它们的均匀度（图1c和d；图2）。类似地，在属的水平N和S添加增加了植物病原菌的香浓多样性和均匀度。在无机层土壤中，无论是在OTU还是在属的水平，N和S添加对病原菌丰富度，香浓多样性或者均匀度都没有影响。

图1 11年的N和S添加对加拿大西部，北方森林土壤中基于OTU水平的植物病原菌多样性的影响。左边的柱状图（a, c）呈现了多样性的观测值和标准误。“CK”代表对照，“+N”代表N添加，“+S”代表S添加，“+NS”代表N和S添加。右边的图呈现了线性混合效应模型的相关系数。“N x S”代表N和S添加的交互作用。统计显著性在每个星号的下方/边上呈现。

图2 11年的N和S添加对加拿大西部，北方森林土壤中基于OTU水平的植物病原菌均匀度的影响。Y轴呈现了每种处理中植物病原菌的每种基本分类单元（OTU）的相对丰度。“CK”代表对照，“+N”代表N添加，“+S”代表S添加，“+NS”代表N和S添加。右边的图呈现了线性混合效应模型的相关系数。

3 共生真菌多样性的变化

N或者S添加都没有改变共生真菌的相对丰度。在OTU或者属的水平，N或者S添加没有改变共生真菌类群的丰富度。大多数共生类群基于OTU水平的香浓多样性和均匀度不受N或者S添加的改变，除了在无机层土壤中N添加降低了基于OTU水平的ERM香浓多样性和均匀度（图3）。大多数共生类群属水平上的香浓多样性和均匀度不受N或者S添加的影响，除了在属的水平N添加增加了N敏感的EMF的香浓多样性和均匀度（图4）。

图3 11年的N和S添加对加拿大西部，北方森林土壤中基于OTU水平的杜鹃花类菌根真菌多样性的影响。左边的柱状图（a, c）呈现了多样性的观测值和标准误。“CK”代表对照，“+N”代表N添加，“+S”代表S添加，“+NS”代表N和S添加。右边的图呈现了线性混合效应模型的相关系数。“N x S”代表N和S添加的交互作用。统计显著性在每个星号的下方呈现。

图4 11年的N和S添加对加拿大西部，北方森林土壤中基于OTU水平的N敏感的外生菌根真菌多样性的影响。左边的柱状图（a, c）呈现了多样性的观测值和标准误。“CK”代表对照，“+N”代表N添加，“+S”代表S添加，“+NS”代表N和S添加。右边的图呈现了线性混合效应模型的相关系数。“N x S”代表N和S添加的交互作用。统计显著性在每个星号的下方呈现。

4 真菌群落物种组成的改变

N或者S添加都对根相关联的真菌的群落组成（作为整体或者真菌功能分类群）没有影响，无论是在OTU还是属的水平。然而，使用物种指标进行分析，我们发现在土壤有机层，N添加导致了Venturia macularis这种病原菌丰度的增加。我们也发现N或者S添加，导致12个EMF物种（有机层中11种，无机层中1种）和2个ERM物种（有机层中1种，无机层中1种）相对丰度的增加。在植物病原菌属的水平，在森林有机层，Venturia是对N添加响应的指示种。在EMF中，我们发现了Tuber属对+N，+S和+NS处理的正响应。在DSE中，Lecythophora和Cadophora属分别代表在森林有机层和无机层的土壤中不添加N。

5 植物病原菌多样性和噬氮植物之间的关系

A. nudicaulis的丰度与土壤有机层中的植物病原菌丰富度呈正相关，但是不是它的香浓多样性或者均匀度。其它噬氮植物的丰度，M. canadense,与植物病原菌的多样性指数不相关。两种噬氮植物总的丰度只与森林有机层植物病原菌丰富度正相关。我们的数据表明大多数根相关的病原菌有多种功能。

我们在阔叶树木占优势的北方森林中调查了根相关的真菌，发现长期N和S添加增加了病原菌真菌的香浓多样性和均匀度。N添加导致了N敏感的EMF多样性增加，然而EMF和DSEs作为一个整体的多样性和丰度，在N和S添加下是保持稳定的。相反地，长期N添加在矿质土壤层中降低了ERM的均匀度。此外，我们确定了Venturiamacularis作为主要的指示者，与N添加相关联，以及多种N敏感的EMF OTU作为与N和S添加相关联的指示物种。我们的发现在阔叶树种占优势的北方森林对于理解长期N和S沉降对真菌多样性和植物群落动态有重要指示意义。

1 N和S添加增加了病原菌多样性

11年的N添加增加了根相关的病原真菌的香浓多样性和均匀度（图1）。长期的N添加通过在群落水平增加易患病的噬氮植物的丰富度可能会增加病原菌多样性。长期N添加的确增加了噬氮物种的丰度，尤其是，A. nudicaulis和M. canadense。除了这个发现，目前的研究还发现根相关的病原菌丰富度与其中一种噬氮植物（A. nudicaulis）的盖度或者两种施氮植物的盖度之和正相关。由于A. nudicaulis盖度的平均丰度为14.0(±4)%，而M. canadense的平均丰度仅仅为2.9 (±0.7)%，这种正相关可能仅仅受A. nudicaulis的驱动。此外，我们发现大多数病原菌OTUs能影响很多寄主。然而，在N添加下增加的A. nudicaulis与普适性病原菌之间的关系仍然需要进一步检验。

此外，除了植物群落组成的改变，寄主防卫能力的降低可能也会加速更多机会主义病原菌的入侵。例如，欧洲白杨，N添加（15-150 kg N ha^-1）抑制了慢速生长并且有较高单宁（化学防卫）含量的基因类型，支持快速生长并且单宁含量少的基因类型。N肥会导致白杨叶片中次生化合物的含量降低，包含condensed tannin，salcin, tremuloiden 以及 total phenols，能够反-真菌效应（确实，我们发现，Venturia macularis,白杨叶和茎枯萎的真菌指示者，是一种与N添加处理相关联的病原菌指示者（图2）。在未来关于白杨的化学防御及其病理症状研究，应该直接检验施氮对白杨枯萎病的影响。

就S添加的效应而言，结果支持我们的假设，即S添加增加了病原菌的香浓多样性和均匀度（图1）；然而，这种机理是不清楚的。之前的研究表明真菌病原菌对S添加的响应依赖真群类群：生物营养的真菌，为了响应S添加，依赖于从寄主获得含S的氨基酸，然而，病原菌很少是寄主依赖的，由于S引起的防卫，可能会导致其降低。确实，在相同土壤的另一个研究中发现S添加增加了白杨叶片中S含量。尽管在生理学研究中已经很好的记录了S引起的防卫，但是在我们的样方中植物类群是否与这种防卫机理共同进化还尚不清楚。因此，在我们的研究中，在S限制的生态系统中，S添加增加寄主植物中有效S，很有可能增加了生物营养学病原菌的丰度。

2 在N和S添加下EMF的稳定性

在我们阔叶树种占优势的北方森林我们发现N和S添加没有显著改变EMF的相对丰度，丰富度和多样性。这与之前占主导的发现相反，即在阔叶的北方森林中N添加降低了EMF丰度和多样性。之前的研究表明，EMF适用于从有机质中获取矿物氮，当N沉降增加时，土壤中有效氮代价增加。因此，有种可能的期待是N沉降降低了N敏感的EMF的丰度和多样性。与这个期望相反，我们发现大多数随着N添加而增加的EMF指示者是N敏感的属。N添加甚至增加了N敏感EMF属水平上的香浓多样性。这种令人意外的结果可能是因为在我们的研究样地10年连续的N添加还没有促使该生态系统饱和。11年N添加实验后持续的N限制可能源于（1）较低的N添加速率，（2）通过EMF驱动N限制。EMF在北方森林受有效N的限制，通过EMF滞留N很常见，尤其当土壤有效N稀有的时候。然而，我们提醒读者，在我们的样方中真正敏感的EMF分类群在没有与寄主植物相关联的直接实验是很难直接评估的。

有趣的是，我们也发现N添加增加了tomentelloid EMF的丰度，据报道这类物种具有分解凋落物的能力。Tomentelloid 真菌在木屑中定殖，产生凋落物分解的酶。它们丰度的增加可能源于N添加下凋落物的增加，因为在我们的样方中，4年的N添加导致了较高的凋落物质量以及凋落物中的N含量。

正如期望的那样，S添加没有改变EMF的丰度和多样性，在我们的研究点很有可能是由于S的限制。之前的研究也报道了在我们相似的土壤中，白杨是S限制的；在加拿大，北方森林S限制是正常的。尽管S添加不影响EMF的丰度和多样性，一些EMF OTUs的相对丰度在+S和+NS的处理中增加了。例如，OTU327Hebeloma cavipes在+NS处理中增加了相对丰度，这个物种在S污染的矿井中有所报道。OTU155Tuber pacificum 以及Tuber属也被定义为指示类群，在+N，+S以及+NS的样方中增加，它们的增加归因于它们向寄主转运硝酸根的能力，或者它们潜在的对抗根病原菌的属性。

3 N和S添加对DSE和ERM多样性的影响

类似于EMF的变化，长期N和S添加没有改变DSE的丰度和多样性。然而，DSE类群明显的稳定性或许会令人困惑，类群内部不同的分类群相反的响应。深色有隔内生菌是一个总称，包括真菌的生态作用范围从共有的到中性和拮抗。尽管缺乏对它们功能的理解阻碍了我们将其分成不同的生态类群，但是指示物种的分析也给我们提供了一些有用的提示：两种DSE属，Lecuthophora和Cadophora，在N添加下丰度都降低，两者都有反-病原菌的属性。这表明N添加可能会抑制那些保护寄主远离病原菌感染的有益的DSEs，会很大程度上使寄主植物在防卫病原菌上妥协，尤其是在N添加已经引起了较高多样性的土壤病原菌的时候。对于DSE’s 稳定性的一种解释是，DSE在无机氮添加后扮演着较高的P吸收角色，因为我们的森林样方很有可能是P-缺乏的。然而，一个强有力的解释等待对DSE’s功能以及它们与寄主植物之间交互作用的进一步研究。

N添加，而不是S添加，在无机土壤中，基于OUT水平，降低了ERM香浓多样性和均匀度（图3），主要是受OUT 21 Oidioodendron maius 相对丰度增加的驱动（图3e）。如果在我们的生态系统中，Oidiodendronmaius与植物共生，N添加下其丰度的增加与它从有机底物中吸收N的主要角色是矛盾的，因为N添加应该会降低这种代价高的ERM寄主的依赖性和碳分配。在N添加下Oidiodendron maius丰度的增加可能通过其他两种情形来解释。第一种情形，如果对于植物而言Oidiodendron maius作为主要的病原菌取代了共生菌，正如其他研究发现的那样，它的生长很有可能会通过增加的凋落物以及凋落物分解中N的释放来增加。或者，Oidiodendron maius 在北方森林树木根尖的EMF的有关联，这似乎会抑制根中的病原菌；因此，它们丰度的增加时寄主防卫病原菌的一个结果。ERM的多功能性对于解释Oidiodendron maius以及ERM多样性的改变是一个挑战。在未来应该分离菌株或者接种菌种以便更好的理解其中的机理。。Oidiodendron maius 在森林有机层土壤中被确定与S添加相关，表明它在EMF根尖中反-病原菌的角色，表明在我们的样方中S添加确实增加了病原菌多样性。

我们总结，人类的N和S沉降会改变与植物根相关联的真菌分类群的多样性，并且会影响真菌对立者和与养分吸收有关的共生者以及寄主的防卫。地下真菌群落的研究采用高通量测序的方法，并且与特定功能群分类（文献检索）相联系，对于理解N和S沉降通过地下生物交互作用影响森林健康是关键的一步。为了更好的理解根相关的真菌怎样调节植物对N和S沉降的响应，未来的研究应该关注于：1）通过在野外从寄主植物中研究病理特征或者通过控制实验向寄主植物接种土壤病原菌检验土壤关键的病原菌对寄主植物的影响；2）通过从噬氮植物中分离根病原菌来确定N添加下增加的病原菌多样性的机理；3）在寄主植物中调查共生真菌类群的生态角色，并且在N和S添加下研究他们与根病原菌的交互作用。

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