编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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本研究所有样品均取自位于26°59′42′′N，104°45′36′′E地理位置上的野生喜马拉雅洋葱（A.wallichii）分布地带。在植物开花期，将所有的植物样本进行挖掘采集，采样后置于预冷的无菌拉链袋中。每个植株所对应的土壤样本在距植株20-30 cm的径向距离内进行采集。此外，在去除表层土后的10 cm深处，采集无植物根系的土壤样本，混合均匀并置于无菌拉链袋中。所有土壤样本一式四份；所有根际样品和每种植物组织类型，一式六份。用无菌手术刀分离不同的植物组织，在实验室对植物样品进行进一步处理。根际土壤在20 ml 0.85%的NaCl溶液中以120 rpm的速度洗涤10 min，得到根际样品。对于所采集的植物样本，在其3-5 cm长的节段进行表面灭菌，获得内生境以及花表面的微生物群落样本。所有样本采用试剂盒进行DNA的提取及纯化，并用于后续分子生物学分析。

1 多样性分析

经过过滤、质检后，8925788条序列被精简到了可代表14140个特征的3380349条序列。在低分类水平上仍没有被分类的高丰度特征进一步在NCBI上通过手动比对，共计3250046条具有13361个特征的序列被纳入后续的研究分析中。在1677 reads水平上进行归一化后，本研究共保留了5266个特征。这些特征在属水平分属于992个分类单元。α稀疏性分析表明，非根际土壤的shannon指数最高（H′=9.34 ± 0.10），其次是根际土壤（H′=8.87 ± 0.46）。而在花，茎以及endorhiza组织中的shannon指数分别为6.11 ± 0.80、6.50 ± 0.44和5.59 ± 0.93，这些微生境中的α多样性差异不显著（p>0.05）。基于未加权的UniFrac距离矩阵来评估β多样性，我们发现，与植物相关的微生境（花、茎和内生境）和与土壤相关的生境（根际土壤和块状土壤）差距明显，反映出明显的统计学差异；而在植物相关的微生境内生境（花、茎和内生境），微生物群落空间组织结构无显著差异（p>0.05）；当评估土壤相关的微生境时（根际土壤和非根际土壤），同样不具有显著性差异（图1）。当每种植物不同的微生境与其对应的非根际土壤或根际土壤进行成对比较时，我们同样发现群落组成之间存在显著差异。此外，所有样品均表现出很高的均匀度，这其中，细菌特征在非根际土壤中的分布最为均匀（E=0.944 ± 0.010），其次是根际土壤（E=0.917 ± 0.030）。内生境的细菌均匀度（E=0.783 ± 0.088）与非根际土壤细菌均匀度之间以及其与根际土壤细菌均匀度之间均表现出显著性差异（图2）。

图1 不同植物组织，根际土壤以及周围非根际土壤之间的β多样性比较。采用主坐标分析（PCoA）方法对不同样本类型之间的群落结构相似性和聚类性进行了可视化分析，这其中包含了三个不同维度的百分比，可解释了最大的变异程度。不同颜色的圆点表示植物微生物群和土壤中不同的样品类型。

图2 A. wallichii微生物组中的细菌群落结构。

2 不同植物微生境中的细菌群落结构

总体而言，不同植物微生境中共包含42种不同的细菌门，这其中，Proteobacteria是根际中的主要优势细菌门（39%），其次是Bacteroidetes（14%）、Acidobacteria（12%）、Actinobacteria（7%），Firmicutes（6%），Chloroflexi（6%），Planctomycetes（6%），Verrucomicrobia（5%）和Gemmatimonadetes（1%）。而非根际土壤中的优势类群为Proteobacteria（28%），其次是Acidobacteria（17%）、Bacteroidetes（11%）、Actinobacteria（9%）、Planctomycetes（8%）、Chloroflexi（7%）、Verrucomicrobia（6%）、Firmicutes（5%）和Gemmatimonadetes（1%）。除此之外，非根际土壤中古菌的相对占有率为5%，而在其他分类样本中，其丰度均低于1%。在花组织中，Proteobacteria是主要优势细菌（51%），随后依次为Firmicutes（20%）、Bacteroidetes（15%）、Actinobacteria（7%）、Deinococcus-Thermus（1%）和Chloroflexi（1%）。茎组织中以Firmicutes（40%）为主，其次为Proteobacteria（33%）、Bacteroidetes（13%）和Actinobacteria（8%）。endorhiza组织中的细菌主要以Proteobacteria（47%）为主，其次是Firmicutes（19%），Actinobacteria（18%），Chloroflexi（2%）和Acidobacteria（2%）。此外，深层次的分析中并不包含相对丰度小于0.5%的细菌门（图3）。为了检测不同细菌的生态位特异性，我们对在丰度上具有显著差异的微生物类群进行了分析。植物组织（花、茎以及内生境）中没有明显差异的丰度特征。将非根际土壤和根际土壤进行比较时，也有相同的观察结果。然而，当将植物组织共生类群与其他微生境进行比较时（a组：花、茎和内生境；b组：根际土壤和非根际土壤），13361个特征中有3595个特征（27%）存在显著差异。在这3595个特征中，仅有11个群落特征是植物组织所特有的（Nocardiopsis，Hymenobacter，Pseudomonas，Aureimonas，Clostridium，Macellibacteroides，Bacteroides，未分类的Verrucomicrobiaceae以及未分类的Microbacteriaceae，Micrococcus和Phascolartobacterium），而3369个群落特征是根际/土壤类群所独有的。另外的215个群落特征是两个类群所共有的。在这215个特征中，只有7个的丰度在植株中显著高于根际/土壤。

图3 植物相关细菌群落与非根际土壤相关细菌群落的均匀性。

3 生境特异性的微生物类群特征

基于系统发育树，我们对269个分类群的进化关系进行了构建（图4）。对于花、茎和内生境样本的微生物类群而言，分别鉴定出44个、62个和29个细菌类群存在于它们各自的核心微生物菌群中。根际土壤有131个核心类群，非根际土壤有177个。总体而言，只有7个细菌类群存在于所鉴定的所有核心分类群中（Pseudomonas，Sphingomonas，未进一步分类的Comamonadace和Bacteroides，以及未进一步分类的Bacteroidales，Acinetobcater和Duganella）。在植物共鉴定出5个独有的核心分类群，包括Streptococcus、Nocardiopsis、Prevotella，Corynebacterium以及Propionibacterium，而非根际土壤和根际土壤中共享了98个核心分类群。在花组织中仅存在1个核心分类群--Macellibacoides，在茎组织中存在19个特有的分类群，而4个分类群仅存在于内生境组织中。土壤中含有40个特有的核心分类群，但对于根际而言，我们并未识别出其独特的核心分类群。

图4 A. wallichii不同组织中常见细菌类群的鉴定。树状图中所有分类群的相对丰度均大于0.05%。为了降低系统发育树可视化的复杂度，我们在属水平上对分类群进行了折叠处理。图中外环中不同的颜色代表所指示的样本类型中出现了不同的分类群。结点大小对应于整个数据集上不同分类群的平均相对丰度；提供了三个具有代表性的结点大小，并提供了各自的百分比。

4 植物微生境之间的连通性评价

进一步我们分析了所有被分析的微生境之间的连通性。所有特征都被可视化为节点，并连接到其各自被检测到的不同植物微生境中。通过分析，我们发现大多数群落特征共存于根际土壤和非根际土壤之间（76个特征），其中43个特征归属于Proteobacteria，12个特征归属于Acidobacteria，6个特征归属于Bacteroidetes，5个特征归属于Actinobacteria，4个归属于Chloroflexi，3个归属于Firmicutes，2个归属于Verrucommicrobia，1个归属于Gemmatmonadetes。其次，花和茎组织之间共享群落特征数量第二（共计20个），其中12个特征归属于Firmicutes，5个特征归属于Proteobacteria，2个归属于Bacteroidetes，1个归属于Actinobacteria。花组织中未检测到其独特的群落特征，但茎组织中被鉴定出15个特有的群落特征，其中7个特征归属于Firmicutes，4个归属于Bacteroidetes，2个归属于Actinobacteria，2个归属于Proteobacteria。植物内生境组织、根际土壤以及非根际土壤分别具有6个、10个和13个独特的群落特征。所有的特征中仅有两个特征是所有微生境所共有的--Pseudomonas和Duganella。此外，还发现Bacillales共享于植物内生境组织和根际土壤之间（图5）。

图5 在群落特征水平上跨植物生境的常见细菌成分的鉴定。为了更好地说明分析样品在植物中的位置，不同的样品类型被绘制在一幅A. wallichii的插图上。连接线将每个特征与其所检测到的生境相连接，而多条边表示出现在不同的生境中。结点颜色表示不同的细菌门，它们的大小对应不同的相对丰度。

5 土壤理化参数

本研究所采集土壤的土壤类型为典型的粘壤土。其pH近中性为6.81，阳离子交换量为12.2 cmol/kg，中等盐度，水溶性盐量为8.5 g/kg。从植物养分来看，全氮含量为1.31%，有机质含量为1.48%，全磷含量为601 mg/kg，全钾含量为114.24 mg/kg。

本研究提供了一种东亚本土野生植物的微生物组图谱及细菌空间组织群落结构，该植物在中国高原地区具有重要生态意义，并可能成为未来生物技术相关资源。Allium wallichii微生物组在地上和地下部分表现出高度的微生境特异性，同时表现出根际效应的缺失，细菌群落结构异乎寻常地呈现均匀性，以及富含假单胞菌（Pseudomonas）等特点。Pseudomonas作为健康葱科植物的生物标志物，同样长期以来也是有益植物细菌的模式生物。在未来，进一步探究与喜马拉雅葱相关的天然Pseudomonas是现代农业发掘新型生物防治资源的可行策略。这些天然Pseudomonas可能含有不同的菌株，这些菌株可以应用到葱科栽培植物上，预防和阻止病害的发生。尤其是下土传真菌病害高度流行的葱科作物种植生态系统中，本研究未新的生物防治方案提供了理论依据。

当比较植物两种内生生境时（根内生组织和茎内生组织），其细菌群落组成有很大的差异性。根内生组织在较高的分类水平上表现出Actinobacteria和Enterobacteriaceae的流行，而茎内生组织则被大量的Firmicutes所定殖。我们假定这种分布是由于两个生态位的物理化学条件的不同所导致造成的。尽管如此，无论是Actinobacteria还是Firmicutes，都可能由于其普遍具有生物防治潜力而含有一些潜在的应用潜能。有趣的是，我们还观察到，与根际微生物群相比，根内生组织中的细菌群落与植物花组织上发现的群落具有更高的相似性。这表明了植物内部所具有的高选择性和过滤效应，这种效应在其他种类的农作物上也曾被观测到。

在喜马拉雅洋葱中，我们已经确定了两个有别于其他大多数植物的细菌群落结构特异性特征。首先，喜马拉雅葱的根际效应较低，与周围非根际土壤相比差异不显著。互补性理化土壤分析表明，该地区天然单一栽培的特点代表了该地区的特征。植物通过特定的分泌物将大量固定的氮和碳引导到根际。这些分泌物在植物的整个生命周期中吸引和滋养这有益的根际微生物。我们推测，该地区的土壤要么受到野生单一植被（喜马拉雅葱）的影响，导致根际土壤与非根际土壤之间的逐渐均一化，要么喜马拉雅葱作为野生植物从周围土壤中吸引微生物的潜力很低。由于喜马拉雅葱的根系比例较小，这使得我们的后一种猜测更存在可能。植物分泌物主要是由侧根分泌，而该点也是结瘤细菌或其他有益内生菌的入口。我们认为第二种假说存在可能的迹象是：茎状植物有其特定的生命周期，并且通常与菌根有关。不同的Pseudomonas菌株因其与某些真菌的正相互作用而为人所知，这些真菌被称为“菌根辅助细菌”。它们的出现可能表明它们在喜马拉雅葱微生物菌群中具有相同的作用，但这一点还有待进一步证实。在本研究中，所有植物组织均采集自其开花期，但以往的研究发现，植物在发育后期表现出较低的根际效应。这种差异性在未来的研究中仍有待进一步的有针对性的分析阐明。

作为喜马拉雅葱微生物组的第二个特异性特征，我们发现其具有很高的微生物多样性，更显著的是不同植物微生境的特殊均匀性。这表明了其处于一种稳定和不受干扰的生态系统（大面积野生自然存在），而这种生态系统在栽培作为中很难实现。虽然科学界对细菌群落均匀度的关注不如对多样性和微生物丰度的关注，但它也是各种生态系统弹性的重要决定因素，尤其是在外界刺激的条件下。先前的研究发现，植物微生物的均匀度普遍较低，但我们假设，我们所观察到的喜马拉雅葱微生物组的均匀性主要源于高原上的特定环境条件，加上长期大面积野生存在，促进了微生物群落与其植物宿主的共同适应。因此，喜马拉雅葱可作为一种模式植物，研究均匀分布的植物细菌群落空间组织结构是如何发展与维持的，以提高近缘栽培作物对生物和非生物胁迫因素的抗逆性，也是未来研究的方向之一。

本研究表明喜马拉雅葱（A. wallichii）具有独特的细菌群落空间组织结构，这些微生物组在不同植物组织中都显示出特定的特征。喜马拉雅葱在其微生物组中表现出的独特特征，使其有别于其他植物。此外，我们观察到假单胞菌（Pseudomonas）是该植物细菌群落中普遍存在的核心微生物类群。综上所述，本研究结果为葱科植物的微生物组研究提供了重要参考，也为今后从野生葱科植物的微生物菌群中挖掘特定的生物资源提供了依据，这些微生物资源可作为其近缘栽培作物的天然保护剂加以开发与利用。

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