编译：微科盟道友留步，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 不同暴露组对斑马鱼体内9-NAnt积累的影响

在暴露试验期间，任何水平的处理都未导致斑马鱼出现死亡或异常，不同暴露组之间9-NAnt浓度差异较大（图1）。当斑马鱼单独接触9-NAnt时，体内9-NAnt浓度随浓度的增加而增加。暴露4、7、21天后，9-NAnt浓度在NA500暴露条件下分别达到9.25、10.46、10.91 μg/g，分别是NA5暴露组的237.18、171.48和129.88倍。以上结果表明，9-NAnt在斑马鱼体内的浓度随暴露时间的延长呈上升趋势，说明9-NAnt具有一定的生物积累性。

比较PE单独暴露和PE-NA复合暴露，可以发现在两种PE-NA暴露水平下斑马鱼体内均检测到9-NAnt。暴露21d后，40PE-NA和10PE-NA暴露组斑马鱼体内的9-NAnt浓度分别高达186.30 ng/g和66.01 ng/g，但单独暴露于PE时，斑马鱼体内的9-NAnt含量很少。此外，在PE-NA复合物暴露过程中，测定了从PE上解吸到水溶液中的9-NA浓度，约为0-0.34 μg/g。这一结果表明PE可以作为载体将吸附到PE上的9-NAnt转移到斑马鱼体内。在Rochman等人的工作中，将放置在现实海湾环境中三个月后的PE喂给青鳉（Oryzias latipes），两个月后，不仅在鱼体内检测到多环芳烃（PAHs）、多氯联苯（PCBs）和多溴二苯醚（PBDEs），而且这些污染物的浓度比暴露于原始PE的组别高出约1.5倍，证明了吸附在微塑料表面的海洋化学污染物可以通过摄食行为进入鱼类体内。与单独暴露于NA500相比，在共同暴露于10PE及NA500的情况下，PE降低了斑马鱼体内93.83%的9-NAnt浓度，这可能是由于PE与9-NAnt共存时，PE作为吸附剂吸附水溶液中溶解的9-NAnt，从而降低了9-NAnt的生物利用度。研究表明，添加微塑料可将斑马鱼幼虫体内17α-乙炔雌二醇和菲的生物利用度分别降低48%和33%。另一项研究还发现，当海洋桡足类（Acartia tonsa和Calanus finmarchicus）暴露在微塑料（PE，10-100 μm）和多环芳烃（菲和芘）共存的水溶液中时，由于PE的吸附能力，溶解的多环芳烃浓度降低，从而降低桡足类对多环芳烃的可及性，减少多环芳烃的生物累积。可以断定，微塑料通过吸附富集有机污染物，降低污染物在水溶液中的生物利用度，而携带其他污染物的微塑料则可能在水动力和风力的驱动下作为远距离运输的载体，从而增加水生生物的生态暴露风险。然而，其他研究表明，微塑料在斑马鱼体内的滞留以及微塑料中三氯生的持续释放促进了三氯生在局部组织中的积累。同样，微塑料的吸附和运输增强了合成酚类抗氧剂在斑马鱼体内的生物累积，这受到颗粒大小的影响。与我们的研究相反，这些结果可能取决于微塑料的特性(化学成分、表面电荷和大小)和污染物(类型、浓度)。

图1 不同处理对9-NAnt在斑马鱼体内生物累积的影响。NA5表示5 μg/L 9-NAnt，NA500表示500 μg/L 9-NAnt，10PE表示10 mg/L PE，40PE表示40 mg/L PE，10PE-NA表示10 mg/L PE-9-NAnt，40PE-NA表示40 mg/L PE-9-NAnt，10PE+NA500表示10 mg/L PE+500 μg/L 9-NAnt。数值表示为平均值±标准差，n=3。不同的字母表示不同组之间存在显著统计学差异（p＜0.05）。

2 不同暴露组对斑马鱼P4501A活性的影响

细胞色素酶P450在生物体内内源性物质的合成和外源性有毒有害污染物的生物转化中起着至关重要的作用，一些环境污染物被P450酶代谢并转化为水溶性小分子，这些小分子可以通过排泄来保护生物体免受环境污染物的胁迫。二恶英类污染物通过与芳香烃受体（AhR）结合诱导P4501A同工酶活性，引起一系列细胞损伤，并且已经证实P4501A同工酶是多环芳烃及其衍生物在生物体内生物催化转化过程中的关键酶。

如图2（a）所示，与对照组（BK）相比，不同暴露组斑马鱼的P4501A活性在4天后显著增加（p＜0.05）。据报道，虾虎鱼幼虫（Pomatoschistusmicrops）暴露于PE（1-5 μm） 96小时后，P4501A酶的生理代谢通路可能会受到微塑料的影响，导致鱼类中7-乙氧基-3-异苯并恶唑酮脱乙基酶（EROD）的生物活性更高。7天后（图2（b）），与对照组相比，在NA500、40PE和40PE-NA暴露组中，斑马鱼的P4501A活性仍然显著升高。但无论暴露4天还是7天，40PE单独暴露与40PE-NA复合暴露对P4501A活性均无显著差异，这间接说明PE携带进入斑马鱼体内的9-NAnt对P4501A活性影响不大。同样，与单独接触多氯联苯相比，当挪威海螯虾（nephrops norvegicus）暴露于携带相同浓度多氯联苯的PS（500-600 μm）和PS与多氯联苯共存的水溶液中时，多氯联苯的生物累积可以忽略不计，并且三种暴露方案对挪威海螯虾的肾脏营养状况和尾部脂质水平均无显著影响。

图2 不同处理对斑马鱼P4501A（a-b）和AChE（c-d）酶活性的影响。BK表示空白对照，NA5表示5 μg/L 9-NAnt，NA500表示500 μg/L 9-NAnt，10PE表示10 mg/L PE，40PE表示40 mg/L PE，10PE-NA表示10 mg/L PE-9-NAnt，40PE-NA表示40 mg/L PE-9-NAnt，10PE+NA500表示10 mg/L PE+500 μg/L 9-NAnt。数值表示为平均值±标准差，n=3。不同的字母表示不同组之间存在显著统计学差异（p＜0.05）。

3 不同暴露组对斑马鱼神经毒性的影响

乙酰胆碱酯酶（AChE）在调节胆碱能神经递质方面起着重要作用，主要存在于动物的神经系统中，其活性易受环境污染物的影响，是一种经典的毒理学生物指示剂。不同暴露组对斑马鱼乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响如图2（c-d）所示。

试验4天后，与对照组相比，只有在10PE暴露的情况下，斑马鱼的AChE活性才显著升高，其他暴露组酶活性的变化无统计学差异，说明低浓度PE对斑马鱼有一定的神经毒性。而玻璃壁上附着的微塑料数量较少，一定程度上降低了微塑料的分散性和生物吸收率。许多研究已经证实，脑内脂质过氧化损伤可能导致含有神经递质的突触前囊膜破裂，使神经递质水平倍增到突触空间，从而对突触空间中过量的乙酰胆碱作出反应，从而导致乙酰胆碱活性增加；在现场试验工作中，已经证明，在150个可检测到微塑料（聚乙烯、聚酯）的鱼样品中，30%的鱼样品的乙酰胆碱酯酶活性和脂质过氧化物水平都是未检测到微塑料样品的两倍，这表明鱼长期暴露于微塑料中可能导致乙酰胆碱对突触间隙高水平乙酰胆碱作出反应。与对照组和40PE暴露组相比，40PE-NA暴露组对斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性有明显的抑制作用，抑制率为25.70%，这可能是由于PE-NA对机体的联合抑制作用所致。PE（1-5 μm）和芘对虾虎鱼幼体的神经毒性实验结果表明，单独或联合暴露于微塑料和芘都严重抑制了乙酰胆碱酯酶活性；此外，镉和PE的联合暴露对鲤鱼（Cyprinus carpio）和紫茎线虫（Symphysodon aequifascitus）的乙酰胆碱酯酶活性有协同抑制作用，这是由于这两种污染物对生物体内质网、高尔基体和细胞膜造成的氧化损伤，进一步干扰乙酰胆碱酯酶的合成和分泌过程。

4 不同暴露组对斑马鱼抗氧化应激系统的影响

氧化应激的控制对机体的正常功能的发挥至关重要，可以通过自由基产生、抗氧化防御和氧化损伤对氧化应激控制进行评估。MDA和LPO是自由基作用于脂质过氧化反应的产物，反映了组织过氧化和细胞损伤的程度。SOD和CAT都是机体必需的抗氧化酶，对清除活性氧自由基（O₂^-、H₂O₂、OH^-）起着至关重要的作用，是环境污染胁迫的指标，间接反映了环境中氧化污染的程度。

如图3（a-h）所示，4天后，与对照组相比，10PE暴露组的SOD、CAT活性、MDA和LPO含量显著增加（p＜0.05），分别增加109.39%、79.19%、30.83%和101.57%。7天后，低浓度（5 μg/L）的9-NAnt单独暴露使得SOD活性显著升高，而高浓度（500 μg/L）9-NAnt单独暴露可显著抑制SOD活性。其他暴露组的SOD活性无显著差异。尽管7天后各暴露组的CAT活性变化无统计学差异，但10PE和40PE单独暴露仍使CAT活性在对照基础上分别下降30.65%和37.20%。除NA5暴露组外，其余暴露组MDA含量无统计学差异，7d后LPO含量变化也与MDA一致。但与NA5暴露组相比，10PE-NA和40PE-NA暴露组LPO水平明显升高，说明微塑料的存在对斑马鱼有一定的氧化损伤作用。

SOD是一种细胞抗氧化防御酶，可催化超氧化物转化为分子氧和过氧化氢，从而保护生物体免受外源污染物诱导的活性氧物质过度产生的影响，微塑料颗粒对ROS的诱导作用已被证明是解释微塑料毒性效应的重要机制。与对照组相比，低剂量PE暴露后，斑马鱼的SOD和CAT活性显著升高，这表明这两种酶对低剂量PE敏感，PE暴露可能诱导了ROS的产生，激活了机体的抗氧化防御系统。此外，机体氧化损伤产物丙二醛（MDA）和过氧化脂质（LPO）水平的升高，进一步证实了低浓度PE对斑马鱼造成了过氧化应激。

Jeong等人证明SOD是一种与PS微塑料诱导的氧化应激防御机制直接相关的抗氧化酶，在暴露于PS颗粒（0.05和0.5 μm，10 mg/L）24小时后，轮虫（Brachionus koreanus）的SOD活性显著增加（p＜0.05），并且该变化与PS颗粒的大小呈负相关。当红色罗非鱼（Oreochromis niloticus）暴露于PS（0.1 μm）24 h后，SOD活性显著升高（p＜0.05），是对照组的1.74-2.84倍；同样地，MDA含量也显著升高，但在14天后没有出现显著变化。此外，与纳米塑料（PS，70 nm）相比，暴露于微塑料（PS，5 μm）3周，显著诱导斑马鱼肝脏的SOD和CAT活性升高，这可能是由于斑马鱼摄取较大的微塑料会导致食物消化抑制和营养缺乏，从而产生氧化应激。当金鱼幼鱼（Carassius auratus）暴露于PS（70 nm）时，CAT活性在24 h后显著升高，但7d后又降低，这表明金鱼幼鱼的抗氧化系统在微塑料暴露初期对PS诱导的氧化应激具有抵抗力，而长时间暴露于MPs则破坏了幼虫的抗氧化能力。

在本研究中，斑马鱼暴露于低浓度PE后，CAT活性在4 d后显著升高，7 d后显著降低，而MDA和LPO含量则一直维持在较高水平，说明微塑料对斑马鱼具有生物毒性。

据报道，在单独和联合暴露于微塑料（PE，1-5 μm）和汞96 h后，欧洲鲈鱼大脑和肌肉中的LPO水平显著升高，导致鱼类氧化应激和脂质损伤，然而，LPO水平和污染物浓度之间没有明显的剂量效应。在Ferreira等人的研究中发现，在金纳米颗粒和微塑料共存的情况下，尽管欧洲虾虎鱼中的LPO水平显著高于单独暴露金纳米颗粒的水平，但与对照组相比，暴露组之间没有显著差异，说明水中微塑料的存在对金纳米粒子对虾虎鱼幼虫的生物学效应没有显著影响。另一项研究表明，无论是单次接触还是PE和芘的混合物都不会导致鱼类LPO水平的显著增加。

从目前的实验结果来看，PE和9-NAnt单独或联合暴露对斑马鱼的毒性作用有限。低浓度PE可通过提高SOD、CAT活性和MDA、LPO水平，刺激斑马鱼的抗氧化应激反应。单独暴露于9-NAnt可通过提高SOD活性刺激斑马鱼的抗氧化应激反应，而作为有机污染物载体的微塑料对生物体的生物毒性有限，这可能与微塑料的粒径有关，从而影响斑马鱼对微塑料的吸收。因此，为了综合评价微塑料和有机污染物的生物毒性效应，需要进一步研究微塑料粒径对污染物生物利用度的影响。

图3 不同处理对斑马鱼SOD酶活性（a-b）、CAT酶活性（c-d）、MDA（e-f）、LPO（g-h）和LDH酶活性（i-j）的影响。BK表示空白对照，NA5表示5 μg/L 9-NAnt，NA500表示500 μg/L 9-NAnt，10PE表示10 mg/L PE，40PE表示40 mg/L PE，10PE-NA表示10 mg/L PE-9-NAnt，40PE-NA表示40 mg/L PE-9-NAnt，10PE+NA500表示10 mg/L PE+500 μg/L 9-NAnt。数值表示为平均值±标准差，n=3。不同的字母表示不同组之间存在显著统计学差异（p＜0.05）。

5 不同暴露组对斑马鱼LDH活性的影响

乳酸脱氢酶（LDH）是动物体内的一种糖酵解酶，催化乳酸和氧化型辅酶I（NAD+）转化为丙酮酸和还原型辅酶I（NADH），进一步参与体内能量代谢，在组织代谢能量供应和物质转化中起重要作用。图3（i-j）显示了不同暴露组对斑马鱼LDH活性的影响。暴露于低剂量PE和PE-NA 4d后，LDH活性均显著升高，单独PE暴露对LDH活性的诱导率（137.07%）大于PE-NA复合物的诱导率（58.01%），说明低浓度PE有促进LDH活性作用，但复合暴露可减弱这种促进作用。高剂量PE和PE-NA暴露组LDH活性均低于对照组，分别显著降低42.87%和27.14%。7天后，40PE-NA组LDH活性仍受到明显抑制，而其它处理组间无明显变化，说明PE-NA复合物暴露对LDH活性的影响大于PE和9-NAnt单独暴露。研究发现，细胞膜损伤导致LDH渗漏到血液中，单独或复合镉和微塑料（PE，1-5 μm）暴露30天后，鲤鱼LDH活性显著高于空白对照组，且复合暴露效果更明显。此外，低浓度的微塑料（1-5 μm，0.25 mg/L）和汞的共同暴露显著诱导鲈鱼肌肉LDH活性升高，表明该生物体增加了厌氧途径的能量供应，以获得额外的能量来调节氧化应激防御和损伤修复等过程。相比之下，鲈鱼肌肉的LDH活性在高浓度微塑料（0.69 mg/L）和汞的共同暴露条件下显著降低，这可能是由于微塑料和汞之间的毒理学相互作用。为了了解微塑料和9-NAnt对鱼类能量产生途径的潜在影响，还需要研究其他相关的生物学参数，如异柠檬酸脱氢酶（IDH）、柠檬酸合成酶（CS）和细胞色素c氧化酶（COX）。

6 综合生物标志物反应指数(IBR)分析

生物标志物对环境中的化学污染物具有预警作用，基于生物标志物的综合反应指数可以综合多种生物标志物对环境污染物的反应。通过整合P4501A、AChE、SOD、CAT、MDA、LPO、LDH等指标，可以计算不同处理组所有生物标志物的IBR值，图4（a-b）展示了微塑料和9-NAnt对斑马鱼的生物毒性作用。

如图4（a-b）所示，各实验组暴露4天后，10 mg/L PE处理对斑马鱼生物标志物的总体影响最大；随着暴露时间的增加，40 mg/L PE-NA复合物对斑马鱼生物标志物的影响在7天后最大，其次是10 mg/L PE-NA处理组，表明PE-NA复合物对斑马鱼的生物毒性存在时间迟滞性。在图4（b）中，通过比较10PE+NA500共存暴露组和NA500单独暴露组，9-NAnt单独暴露对斑马鱼生物标志物的毒性效应大于共存暴露组，这可能是由于9-NAnt单独暴露（10.46 μg/g）的生物累积性大于共存暴露（0.66 μg/g）。研究表明，当微塑料与其他有机污染物共存时，可作为吸附剂吸附水环境中的污染物，从而降低溶解污染物的浓度，降低有机污染物的生物利用度，说明微塑料的存在可以在一定程度上减轻9-NAnt对斑马鱼的生物毒性。

图4 斑马鱼暴露4天和7天后生物标志物（a-b）的IBR分析。BK表示空白对照，NA5表示5 μg/L 9-NAnt，NA500表示500 μg/L 9-NAnt，10PE表示10 mg/L PE，40PE表示40 mg/L PE，10PE-NA表示10 mg/L PE-9-NAnt，40PE-NA表示40 mg/L PE-9-NAnt，10PE+NA500表示10 mg/L PE+500 μg/L 9-NAnt。

7 不同暴露组对斑马鱼肠道微生物群落的影响

图5展示了斑马鱼肠道内的检测到的大量16S rRNA基因序列。在门水平（图S2），PE和9-NAnt明显改变了斑马鱼肠道的群落结构。暴露于40PE-NA、NA500和10PE+NA500后，斑马鱼肠道中Proteobacteria的相对丰度有不同程度的增加，分别比对照增加12.68%、34.31%和50.13%。而暴露于40PE-NA、NA500和10PE+NA500后，斑马鱼肠道中的Firmicutes和Fusobacteriota丰度明显下降。此外，当斑马鱼暴露于NA500和10PE+NA500后，Verrucomicrobiota的相对丰度分别比对照组高19.89%和5.72%，40PE和40PE-NA的相对丰度分别为0.72%、0.68%和1.32%，这可能与9-NAnt在斑马鱼体内的生物积累有关。实验结果表明，9-NAnt对斑马鱼肠道的群落组成具有显著影响影响。此外，在目水平上，所有暴露组的斑马鱼肠道细菌组成也发生了很大变化。与对照组相比，在暴露于NA500和10PE+NA500 21天后，斑马鱼肠道微生物群（包括Firmicutes所属的Erysipelotrichales和Fusobacteriota所属的Fusobacteriales）的相对丰度也出现了明显下降。与此相反，暴露于NA500和10PE+NA500的细菌群落，包括Proteobacteria所属的Rhizobiales, Aeromonadales和 Burkholderiales及Verrucomicrobiota所属的Chthoniobacterales和 Verrucomicrobiales，出现了显著的增加。相比之下，无9-NAnt暴露组斑马鱼的优势菌群为：Erysipelotrichales,Fusobacteriales, Rhodobacterales, Bacteroidales 和Lachnospirales。而9-NAnt的存在使斑马鱼肠道微生物群的组成发生了很大的变化，主要包括Rhodobacterales,Rhizobiales, Aeromonadales,Erysipelotrichales, Kapabacteriales和 Lachnospirales。

肠道菌群失调，即肠道微生物群落的改变，已经被证实与微生物引起的宿主肠道渗透性变化及炎症的发生有关。Proteobacteria的增加是导致肠道炎症产生的原因，Proteobacteria的增加与脂多糖的产生有关，脂多糖会破坏肠粘膜屏障、增加肠渗透性，从而引起炎症。此外，Proteobacteria所属的legionellales是一种广泛存在于淡水环境中的病原菌，是原生动物的细胞内寄生虫，可引起肺炎和其他呼吸道疾病。在本文中，在暴露于10PE+NA500, NA500 and 40PE-NA的组别中，legionellales的相对丰度分别比对照组高了21.12、4.41和1.53倍，表明这些涉及9-NAnt的处理可能增加斑马鱼罹患呼吸系统疾病的风险。在40PE-NA, NA500 and 10PE+NA500暴露组中，Proteobacteria的数量出现了显著的增加（39.83%，77.27%）。Huang等人还发现，随着微塑料浓度的增加，孔雀花鳉幼鱼肠道中Proteobacteria丰度增加。相反，在40PE-NA, NA500 and 10PE+NA500暴露组中，Fusobacteriota的数量在降低。Fusobacteriota可将碳水化合物（包括粘蛋白）代谢成短链脂肪丁酸盐，为宿主提供许多益处，包括向胃肠细胞提供能量，作为抗癌和抗炎剂，并抑制潜在的淡水鱼病原菌。 Fusobacteriota比例的降低会对宿主肠道能量供应和正常免疫系统稳态的维持产生较大的负面影响。以往的研究表明，Bacteroidetes 和 Firmicutes的相对比例与个体的体重健康有关，Bacteroidetes 和 Firmicutes比例失调可导致个体肥胖，体重与Firmicutes呈正相关，与Bacteroidetes呈负相关。Bacteroidetes比Firmicutes具有更多的糖酵解酶，主要用于摄取多酚并将其发酵成酚类化合物，单不饱和脂肪酸和可溶性纤维的消耗也与Bacteroidetes的数量密切相关。这些研究表明Bacteroidetes和Firmicutes影响生物体的能量代谢、糖代谢和脂质代谢。此外，据报道，宿主肠道微生物群共代谢产物的改变是由肠道微生物群的扰动引起的。组氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、三磷酸腺苷（ATP）、马尿酸等碳水化合物和氨基酸代谢与Firmicutes和 Verrucomicrobia数量呈正相关。然而，脂质、碳水化合物和氨基酸代谢（如谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸和丙酮）与Firmicutes 和 Verrucomicrobia数量呈负相关。此外，Verrucomicrobia的丰度与foxp3基因的表达呈正相关，foxp3与炎症水平相关。基于以上研究结果，一些微生物群落的变化与机体的代谢、疾病、能量供应和免疫等有着重要的关系，但有些微生物的功能尚不清楚。

图5 暴露21天后，目水平上的斑马鱼肠道细菌群落组成。BK表示空白对照，40PE表示40 mg/L PE，40PE-NA表示40 mg/L PE-9-NAnt，NA500表示500 μg/L 9-NAnt，10PE+NA500表示10 mg/L PE+500 μg/L 9-NAnt。只有相对丰度大于1%才展示在图中。

微塑料在环境中无处不在，使其不可避免地会遇到其他类型的污染，导致协同污染的发生。因此，研究微塑料与其他污染物的相互作用及其生物效应具有更加显著的环境意义。本文研究了9-NAnt、PE-9-NAnt复合物和PE+9-NAnt共存条件下9-NAnt在斑马鱼体内的积累特性。结果表明，具有较强吸附能力的微塑料可以作为9-NAnt在斑马鱼体内的载体。然而，在斑马鱼共同暴露于9-NAnt和PE的情况下，微塑料显著降低了9-NAnt在斑马鱼体内的生物累积量，仍高于暴露于PE-9-NAnt复合物时的生物积累量。酶活性的变化表明，在短期内，单独暴露于或复合暴露于PE和9-NAnt均能显著影响斑马鱼体内9-NAnt的生物代谢，而单独暴露于低浓度PE可引起斑马鱼明显的神经毒性和氧化应激。随着暴露时间的延长，PE或9-NAnt单独暴露对斑马鱼体内酶活性的影响不再明显，而PE-9-NAnt复合暴露对斑马鱼的神经毒性和能量代谢的影响显著，表明复合暴露对斑马鱼的生物毒性具有延滞性。暴露组肠道微生物群落的组成也发生了明显的变化，这些变化大多与体内的炎症和能量代谢有关，并受到9-NAnt在斑马鱼体内的生物累积的强烈影响。此外，本研究为正确评价微塑料作为鱼类有机污染物吸附载体的生物毒性提供了新的思路。综合酶活性分析和肠道微生物组成分析可作为微塑料等污染物复合污染生态风险评价的重要指标。

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