原名：Vaginotypes of the human vaginal microbiome

译名：人类阴道微生物群的阴道类型

期刊：Environmental Microbiology

IF：4.933

发表时间：2021.02

通讯作者：Marco Ventura

通讯作者单位：意大利帕尔马大学

1.选择公开可用的数据集

根据以前关注人类相关微生物群的研究，进行了广泛的文献搜索，以检索与涉及足够数量的阴道样本的鸟枪宏基因组学研究相关的所有公开可用数据，从而获得强大的统计能力。具体而言，从七个公开可用的数据集检索涵盖三个不同的国家的阴道微生物群数据（表1）。总的来说，在这项研究中进行的多人群队列Meta分析包括对应于来自健康成年女性，还包括333名孕妇（表1）。

表1 Meta分析中样本的元数据

2.健康非孕妇微生物群的荟萃分析

共检索了来自四个队列的979份公开样本，包括健康非孕妇的阴道样本。利用大量数据集和鸟枪宏基因组方法提供的可能性，通过使用METAnnotatorX平台的重新分析，在物种水平上准确地分析细菌。鸟枪宏基因组元分析允许对收集的健康非妊娠阴道样品的生物多样性进行深入调查。详细来说，物种丰富度分析显示平均物种数为24±18，证实了之前提出的观点，即与其他人体部位相比，健康阴道微生物群的特征是微生物多样性相当低。从细菌组成来看，阴道标本中乳杆菌属（Lactobacillus）占优势，其次是加德纳氏菌属（Gardnerella）、弧菌属（Vibrio）和隐杆菌属（Atopobium），平均丰度分别为7.42%±17.53%、3.10%±10.51%和2.99%±14.43%。此外，只有皱纹乳杆菌（L. crispatus）（平均丰度为41.52%±42.63%）、简氏乳杆菌（L. jensenii）（平均丰度为4.09%±11.58%）、小球藻（L. iners）（平均丰度为13.87%±27.21%）和加瑟氏乳杆菌（L. gasseri）（平均丰度为4.73%±15.80%），证实了乳杆菌在阴道环境中的优势种。

3.阴道类型的预测

收集的数据集用于确认阴道CST的存在，即共同的分类模式，也称为阴道型，并确定可能的新CST或亚CST。阴道类型的筛选通过等级聚类（HCL）进行聚类分析 （图1A），并通过3DBray-Curtis PCoA进行确认（图1B）。如前所述，已识别的聚类必须由至少10个样本来表示，才能被定义为假定的聚类中心 （图1C）。此外，基于宿主地理起源的多囊卵巢综合征分析显示宿主地理起源和阴道微生物群分布之间没有相关性。健康非妊娠阴道样品的宏基因组分析使得能够确认四种CST，即I、II、III和V（图1）。具体而言，分析显示，49.03%的样本被归类为第一类受试者，其次是第三类受试者、第二类受试者和第五类受试者，它们在分析样本中的患病率分别为16.65%、7.05%和2.86%（图1C）。此外，17.47%的样本似乎对应于CST，CST被描述为最具异质性和争议性的阴道类型。事实上，CST最初被定义为没有优势种。在这种情况下，基于当前分析的结果，13.38%的样本似乎以加德纳菌属（G. vaginalis）的优势存在为特征，在此称为CST-G。研究分析揭示了另外两种可能是新的CST的存在，其特征是玫瑰柯库里亚/肺炎克雷伯菌（Kocuria rosea/Klebsiellapneumoniae） （此处命名为CST-KK）和哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）（命名为CST-Vh）占优势，在所有阴道拭子样本中的患病率分别为3.06%和3.88%（图1C）。虽然收集的阴道样本被归类为来自健康受试者，但这两种推定的新型CST似乎以泌尿道病原体的存在为特征，因此可以代表阴道环境从健康状态向疾病状态转变的生物标志物。不幸的是，缺乏这些样本的纵向数据阻碍了这一假设的验证。本研究中获得的分类概况用于评估代表每个指定阴道型的最普遍的分类群。如图2所示，作者观察到没有单一物种在两个CST之间普遍存在，因此表明不存在物种水平的阴道核心微生物群。此外，共有34个分类群的存在似乎与特定的阴道类型相关，这表明阴道环境的低生物多样性特征伴随着与已确定的阴道类型严格相关的分类学可变性（图2）。

图1 阴道类型鉴定。图A显示了通过等级聚类（HCL）分析获得的健康阴道样本的圆形分支图。分支图突出了通过HCL分析确定的不同CST。图B报告了健康阴道样本的主坐标分析（PCoA），按阴道类型细分。图C显示了与已确定的CST和亚CST相对应的细菌的平均丰度和流行率。

图2 预测阴道类型分类群的评估。

4.sub-CSTs的确定

收集的大量阴道样本和深入的鸟枪基因组分析可以突出推测亚CST的存在。健康的非妊娠阴道样本的亚CST是通过物种水平的分类图谱的HCL分析（图1A）和3D Bray-Curtis PCoA（图1B）来鉴定的。详细地说，HCL聚类分析显示CST I、II、III和CST-G（F、I、G）有明显的亚群。1C），由PCoA表示的PERMANOVA证实。有趣的是，CST I包括一个主要亚群，这里命名为CST Ia （平均丰度为89.66%±10.99%）和另外三个亚群，即CST Ib，CST Ic和CST Id，以高丰度（>53.72%±16.40%）为特征，同时伴有拟肺炎克雷伯氏菌（平均丰度为18.90%±5.51%）、伊氏志贺氏菌（平均丰度为22.77%±8.72%）或简氏志贺氏菌（平均丰度为18.60%±2.56%）（图1C）。

        此外，CST II的HCL分析显示有两个亚群，即CST IIa和CST IIb亚群，CST IIa以加瑟氏菌（平均丰度为68.41%±27.46%）为特征，CST IIb亚群的高丰度（平均丰度为51.81%±10.36%）伴随着斯卡多维双歧杆菌（平均丰度为28.35%±2.72%）（图1C）。CST III可分为CST IIIa亚组和CST IIIb亚组，CST IIIa亚组以L iners（平均丰度为72.44%±17.99%）为主，CST IIIb主要由L iners（平均丰度为56.12%±9.08%）和L. jensenii（平均丰度为32.72%±10.39%）组成（图1C）。此外，CST-G还显示出亚群的存在，即CST-Ga主要以加德纳氏菌（平均丰度为54.51%±14.72%）和CST-GB（平均丰度分别为40.75%±10.49%和36.77%±11.45%）表现为加德纳氏菌属（Gardnerella）和阴道阿托巴氏菌（Atopobium Viinae）的种类（平均丰度分别为54.51%±14.72%和36.77%±11.45%）（图1C）。

5.阴道类型成员之间的协方差以及优势种在确定阴道微生物区系分类组成中的作用

为了确定每种阴道类型的主要优势类群是否包含在定义阴道微生物区系的总体分类组成中，作者通过Spearman系数进行了协方差分析。这项分析表明，卷叶乳杆菌（L. crispatus）和延氏乳杆菌（L. jensenii）对其他细菌的存在产生了最高的负面影响能力。此外，与其他表征阴道类型的优势类群相比，L. crispatus的正相关性最低，为9.38%。这些结果支持这样的观点，即CSTI在对抗其他细菌的侵袭和维持阴道环境中的低生物多样性方面发挥着关键作用，这种情况被认为与阴道健康有关。相比之下，阴沟肠杆菌（L. iners）和阴道革兰氏菌（G. vaginalis）分别是CST III和CST-G的代表种，它们彼此呈正相关，似乎促进了一些泌尿系病原菌的存在。因此，尽管CST III在女性中的患病率相当高（16.65%），但似乎它促进了阴道感染。有趣的是，肺炎克雷伯氏菌/罗西克雷伯氏菌（K. pneumoniae/K. rosea）和哈维埃弧菌（V. harveyi）分别是CST-KK和CST-VH的特征菌种，它们与变形杆菌门的菌种（如Raoulteaplanticola和Haemophilusparainfluenzae）呈正相关，与乳杆菌种（Lactobacillus）和詹森乳杆菌（Lactoba-cillus jensenii）呈负相关，突出了这些分类群改变同源环境的能力。

6.健康孕妇微生物区系的Meta分析

对健康孕妇微生物区系的Meta分析表明，在怀孕期间，荷尔蒙变化会导致生殖道粘膜的免疫调节和理化变化。这些变化会影响阴道微生物区系的组成和功能，使其有别于非孕妇。为了确定健康的未怀孕妇女和怀孕妇女之间可能的差异，作者分析了333份涵盖孕妇阴道样本的元基因组数据。物种丰富度分析表明，妊娠妇女阴道微生物区系（平均物种丰富度为1714）与非妊娠妇女阴道微生物区系（平均物种丰富度为2418）相比有统计学意义的简化，证实了怀孕期间阴道微生物区系向低生物多样性转变。此外，HCL和PCoA分析可以确定阴道类型和妊娠之间的联系（图3）。详细地说，Meta分析能够观察到CST I和CST III在孕妇中的患病率均>30%，因此是最常见的CST，而CST II、CST-G、CST IV和CSTV的患病率小于13%（图3C）。然而，与健康的非妊娠妇女相比，CST I的患病率较低（孕妇为36.94%，非妊娠妇女为49.03%）。此外，怀孕似乎与CST III和CST V的较高患病率相关（图3C），从而表明阴道微生物区系整体动态平衡的不稳定。这一结果证实了孕期细菌群落确实从以乳杆菌属为主的一种阴道类型转变的说法。到另一个由乳杆菌属（Lactobacillus spp.）主导的CST，但很少到CST-G或CSTIV。为了确定孕妇阴道样本中可能存在的特异性亚CST，进行了聚类分析。HCL和PCoA分析可以确定CST Ia亚群（患病率为33.63%）和CST Ic亚群（患病率为3.30%），这是以前在非妊娠样本中发现的。此外，CST V还可分为CST Va亚群（平均丰度为57.36%±25.52%）和一个新亚群CST Vb（图3C）。这些数据表明，未来将这种比较分析与新样本相结合，可能会导致识别出更多的次级CST。为了确定未怀孕和怀孕妇女阴道微生物区系的分类特征可能存在的差异，作者对两组观察到的平均分类组成进行了t检验。聚焦于两组中至少一组显示平均相对丰度>0.1%的细菌分类群。该分析可以确定46个微生物分类群在统计学上的显著差异。这些变化表明阴道微生物区系动态平衡被破坏。

图3 娠阴道类型鉴定。图A显示了通过等级聚类（HCL）分析获得的孕妇健康阴道样本的圆形分支图。分支图突出了通过HCL分析确定的不同CST。图B报告了对孕妇健康阴道样本的主坐标分析（PCoA），按阴道类型细分。图C显示了与已确定的CST和亚CST相对应的细菌的平均丰度和流行率。

7. 阴道型的功能能力

   每种预测的阴道类型的不同分类对应于特定的微生物群，每个微生物群都有其特定的基因谱系。为了探索每个已鉴定的CST的遗传特征，总共对133个鸟枪式元基因组学样本进行了分类。作者重点比较了各种确定的CST和CST I，即由L.crispatus主导的CST，因为它在支持阴道健康方面发挥了积极的作用。细菌素相关基因的筛选表明，平均而言，CST I编码的细菌素丰度是所有其他CST的10倍（平均分别占整个元基因组数据集的0.03%和0.003%） （图4A）。有趣的是，III类细菌素代表通过细胞壁降解导致细菌细胞死亡的多肽（IIIa类）和分散细胞膜电位并导致细胞死亡。此外，作者基于MetaCyc数据库 （图4B）对参与分解代谢途径的遗传谱系进行了筛选。通过深入评估每个生物合成和降解途径图谱的相对丰度变化，可以识别出44条途径，它们的CST I丰度高于分析中包括的所有其他六个CST（图4B）。值得注意的是，阴道粘液分泌物富含唾液酸，参与降解唾液酸N-乙酰神经氨酸的基因丰度较高，表明CST相关微生物对阴道环境的适应性更强。

图4 阴道型的功能能力。图A显示了不同CST中细菌素的丰度，即I、II和III类细菌素图。揭示了44条途径中每条生物合成和降解途径的相对丰度，其中CST I的丰度高于分析中包括的所有其他6条CST。

在这项研究中，作者对1312名健康女性的阴道样本进行了一项深入的Meta分析，该分析基于总共7个公开可用的鸟枪元基因组数据集。Meta分析证实了被定义为CST的阴道类型的存在，即CST I、CST II、CST III和CST V，并对有争议的CST IV进行了详细的剖析。提出了新的阴道类型CST-G，该阴道类型以加德纳氏菌属的成员为主。此外，阴道类型和阴道微生物区系的分类组成之间的协方差分析支持CST I在维持阴道健康、防止其他细菌（特别是阴道病原体）的定植和维持低生物多样性方面的积极作用。相反，CST III和CST-G似乎促进了泌尿生殖道中可能的致病菌的建立。此外，对孕妇阴道微生物区系的分析显示，与非孕妇样本相比，物种丰富度显著降低，并显示CST III和CST V的高流行率，因此表明阴道微生物区系的整体动态平衡不稳定。此外，据预测，与所有其他CST相比，CSTI编码的III类细菌素丰度更高，并且似乎包含了一种通过促进阴道环境稳定而发挥有益作用的基因谱系。