编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 不同气候条件下施肥对土壤有机碳的影响

经过12年的土壤移置，气候变暖土壤（TransS2处理）的有机碳损失明显较少（图1）。基于核磁共振技术（NMR）我们进一步测定了SOC分子基团的变化（图1）。施肥显著提高了TransS2土壤顽固性C（RC）中芳香碳的含量。其中，TransS2施肥土壤的芳香碳含量是TransS1的2.7倍，说明在较温暖的气候条件下，施肥能够增加土壤的腐殖化程度。对于土壤易分解碳（LC）而言，未施肥土壤中O-烷基C和羰基C有所减少，而在气候变暖时，施肥显著减缓了土壤LC的损失。施肥降低了TransS2中烷基/O-烷基的比值，表明施肥和土壤转运可能抑制了易分解小分子碳的消耗。除此之外，施肥和土壤移置还改变了土壤的pH和土壤养分。

图1 土壤移置12年后，不同气候条件下施肥对土壤有机碳及其分子群的影响。a代表在不同气候条件下施肥对SOC以及其分子类群（烷基C，O-烷基C，缩醛C，芳香C和羰基C）的影响；b中A/O-A%（%）=烷基C峰面积（0-45 ppm）/O-烷基C峰面积（45-90 ppm）*100%，芳香性程度（%）=芳香C峰面积（110-160 ppm）/总峰面积（0-160 ppm）*100%。图中*，**，***分别代表p < 0.05，p < 0.01和***p < 0.001。

2 活细菌群落和总微生物群落组成和结构的变化

在OTU水平上，采用贝叶斯方法来确定移栽后Mollisol中细菌群落的潜在来源。移置到TransS1后，土壤微生物的最大潜在来源是原位Mollisol（占69%），其次是未知来源（21%），仅10%来自土著Inceptisol土壤。TransS2样本也得到了类似的结果。这些结果表明，只有一小部分微生物来自当于TransS1和S2的当地土壤（Inceptisol和Ultisol）。

施肥显著改变了不同气候条件下细菌群落的组成和结构（图2a），这其中活微生物的α多样性有所增加，而总微生物的α多样性降低。进一步通过探究环境因素对活细菌群落和整个细菌群落的影响我们发现（表1），与对土壤物理化学特性的影响相比，施肥和气候因素（MAT和MAP）是影响活的微生物和总微生物群落结构变化的主要因素（p <0.05）。

图2 活微生物和总微生物的群落组成及模块化分析。a代表活细菌群落和总细菌群落组成的比较，图中仅显示了相对丰度排名前十的细菌门，其他细菌门均有“其他门”所表示；b基于随机森林模型，在活微生物和总微生物中排名前八的网络模块对土壤不稳定碳（LC）成分变化的贡献。

表1 微生物群落组成与土壤理化性质（pH，SOC，TN，TP，NO3--N, NH4+-N），气候条件变化和施肥之间Mantel及偏Mantel检验。

3 活微生物/总微生物与土壤易分解碳和顽固性碳之间的关系

Pearson相关分析表明，活菌和总菌数分别有1148个和874个OTUs与易分解碳（LC）显著相关（p<0.05），分别有134个和120个OTUs与顽固性碳（RC）显著相关（p<0.05）。网络模块化分析表明，与LC相关的OTUs可解析为8个顶级模块，分别占整个活菌网络和总微生物网络的82.0%和88.4%。在随机森林模型中，分别有5个源自活微生物的模块和3个源自总微生物的模块对LC的变化有显著的贡献，分别可以解释60.4%和44.9%的贡献程度（图2b）。与RC相关的OTUs的模块化比与LC相关的OTUs更简单。总微生物对于RC变异的解释（78.81%）要强于活微生物对RC变异的解释（70.69%），并对RC有正向的贡献。

4 活微生物对C组分贡献的实验分析

基于Raman-D₂O，我们进一步通过探究活微生物的代谢活性，以确定其在土壤移置后的降解能力（图3）。以D₂O为底物代谢的细菌培养物在2040-2300 cm^-1范围内显示出明显的C-D拉曼谱带（图3a）。TransS1和TransS2中C-D与（C-D+C-H）的比值显著高于原位土壤以淀粉为碳源的C-D/（C-D+C-H）的比值，而以纤维素为碳源的C-D与（C-D+C-H）的比值则相反（图3B）。

图3 在施肥土壤中，以D2O同位素标记同时结合单细胞Raman光谱技术探究不同碳源培养条件下土壤微生物的代谢活性。a左侧代表拉曼光谱，右侧代表C-D比率（C-D/（C-D+C-H））以及在50% D2O的无机盐+淀粉培养基中培养24h后土壤细菌的拉曼mapping图；b代表拉曼光谱，C-D比率以及在无机盐+纤维素培养基中培养的土壤细菌的拉曼mapping图；**和***分别代表p < 0.01和p < 0.001。

施肥导致土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性显著降低（图4a）。通过接种土壤悬浮液来测试活微生物分解不同碳源（淀粉和纤维素）的能力（图4b），我们发现，施肥显著减少了淀粉和纤维素分解产生的CO₂。这表明，施肥减少了TransS2中不稳定碳和稳定碳的损失。此外，通过测定活菌在淀粉和纤维素中的生长情况（图4c），我们发现，在气候变暖条件下，施肥土壤中细菌的生长活性低于未施肥土壤中细菌的生长活性。特别是在以淀粉为C源培养中，施肥土壤中的细菌加速进入稳定期，而未施肥土壤中的细菌继续生长。

图4 不同气候条件下施肥对不同碳源的土壤微生物代谢能力和生长的影响。a代表土壤酶活性（α-和β-葡萄糖苷酶）；b代表微生物降解淀粉和纤维素能力的微环境实验；c代表以淀粉和纤维素为C源培养条件下活的土壤微生物的生长曲线（n=9）。

5 基于氨基糖分析探究土壤微生物残体（necromass）对SOC的贡献

土壤氨基糖作为微生物残体（necromass）的示踪物，通过测定我们发现，在TransS2（图5a）中，施肥显著增加了微生物残体的数量。此外，移置12年后，微生物残体的积累增加。基于偏RDA方法对活的微生物和死的微生物以及土壤理化性质对LC和RC组分的贡献进行分析发现，活菌对LC组分的贡献率为30.9%，远高于死菌的贡献率（1.1%）；在RC组分方面，死的微生物的贡献率为22.3%，高于活微生物的贡献率（6.4%）（图5b）。这一结果表明，死的微生物可能是土壤RC的主要贡献者。

图5 微生物坏死体对土壤SOC的贡献。a代表作为微生物残体生物标志物的土壤氨基糖含量，包括来自死真菌的氨基葡萄糖和来自死细菌的氨基半乳糖和muramic，大写字母表示不同气候条件下施肥效应具有显著差异，小写字母表示原位与移栽之间具有显著差异；b代表土壤地球化学性质、活细菌生物量和细菌氨基糖含量对土壤LC和RC影响的偏冗余分析（pRDA）。

在气候变化和人类活动的共同影响下，陆地生物圈中氮添加对土壤有机碳的调节引起了人们的广泛关注。在一般农业经营中，由于秸秆或堆肥被视为是提高土壤中有机碳含量的最佳选择，秸秆或堆肥的投入通常被用于土壤有机碳的补充策略。然而，这些方法没有充分反映当前对有机碳固存的看法，忽视了微生物生物量的作用。基于微生物C泵理论，微生物代谢产物或残体可以对RC-SOC有很大的贡献，这强调微生物在碳固存过程中的调节作用。因此，有必要进一步揭示长期施肥对土壤有机碳影响的微生物机制，并在不同气候条件下通过田间试验和栽培试验相结合进行验证。先前的研究表明，在气候变暖的条件下，土壤微生物残体在RC-SOC的形成过程中起着重要的作用。施肥改变了土壤微生物群落的组成和代谢特征，使土壤微生物残体积累更多，有利于土壤长期固碳。本研究中，我们构建了一个概念框架，以揭示在氮缺乏和充足的情况下，微生物生理代谢和残体对SOC封存的调节作用的潜在机制（图6）。在温暖气候条件下，施肥可通过促进微生物残体的积累来补充土壤中的顽固性碳（芳香族C），同时活微生物较少的消耗了SOC中不稳定的C组分（如O-烷基C、羰基C等）。

图6 不同气候下受精土壤微生物潜在调节机制示意图。

微生物可以反复积累代谢物或微生物残留物（完整的细胞或在裂解和碎裂之后的碎片），并将它们稳定在土壤颗粒内或土壤颗粒上。本研究中，我们发现总微生物对土壤RC有促进作用，并解释了施肥和移土复合作用下土壤RC的变化。此外，活微生物的生物量只占土壤有机碳的不到5%，通常认为它们对土壤碳储存的贡献可以忽略不计。但基于马尔可夫链方法（Markov chainapproach），预计土壤微生物残体C库的大小大约是土壤微生物生物量的40倍。一项全球分析中曾发现，在温带农业土壤中，微生物残体的贡献平均占总有机碳的55.6%。我们以氨基糖为生物标志物，发现微生物残体对稳定C组分的贡献率（22.3%）高于活微生物对其的贡献率（6.4%），这表明微生物残体对SOC的贡献很大。微生物残体的积累受环境因素控制，影响土壤碳汇过程。最近的研究表明，在冬季变暖的情况下，SOC的物理保存得到了加强，并强调了土壤微生物在团聚体生命周期中的作用。因此，我们推断，在气候变化和施肥的共同作用下，微生物能可以通过增加土壤中微生物残体，从而对土壤稳定碳库做出贡献。

土壤中微生物残留物的积累对土壤碳的保护和固存具有重要意义。在本研究中，我们发现在气候变暖时，施肥显著增加了微生物残体的积累（图5a），这可能是增加土壤稳定碳和延缓土壤有机碳流失的直接证据。其原因可能有以下几点：1、施肥会富集那些资源获取策略丰富的微生物成为优势种，在气候变暖条件下增加这些物种的生物量，并直接促进微生物残留物的积累；2、通过施肥增加地上植物根系分泌物（外源C）的输入，调节土壤C/N，间接增加土壤微生物残体量；3、在降雨量和温度较高的气候中，施肥激发的微生物残体可以与土壤表面的矿物质紧密结合，形成稳定的、周转时间较长的有机质，不容易通过矿物质保护而分解。我们的研究表明，在长期气候变化下，施肥增加的微生物残体对有机碳的形成有重要贡献，这为微生物合成代谢是稳定的有机碳库的主要贡献者提供了坚实的证据。

在温暖气候条件下，黑沃土（Mollisol）中有机碳含量显著降低，主要是由于土壤有机碳中易分解碳（LC）含量的减少。有研究发现，温度升高会增加编码LC降解酶的微生物功能基因的丰度。类似的，本研究同样发现，在土壤移置后，降解不稳定碳源的活菌的代谢活性增加。然而，在气候较暖的施肥条件下，这种增加的幅度较小（图4）。在施肥条件下，微生物碳源可能主要来自根分泌物或植物残渣，而不是土壤有机碳。这与N-Mining假说（加速土壤有机质的分解以获取更多的氮）所阐述的--与不施肥土壤相比，施肥土壤中有机碳的损失显著减少相一致。随着新鲜根系分泌物输入量的增加，微生物需要消耗SOM来获取N，以满足其营养需求。特别是在未施肥的土壤中，作物生长需要大量养分，植物和微生物之间的交流将得到加强，微生物从根中获得碳，并将土壤有机质中的N（和P）释放出来为根系所吸收。在施肥的情况下，微生物不会为了满足自身或作物的养分需求而增加对有机质氮的获取。其次，能量诱导的胞外酶合成可以用于解释这种负矿物氮诱导的启动效应。微生物胞外酶可以直接催化SOC的分解。本研究中我们发现，在气候变暖的情况下，与不施肥相比，施肥土壤中微生物的胞外酶活性降低，利用淀粉作为易分解碳源的呼吸减弱，表明碳矿化能力降低。这可能表明细胞能量处于低能量状态，不会发出增长潜力的信号，因此减少了不必要的能量消耗。在气候变暖条件下，施肥土壤中细菌的生长曲线低于未施肥土壤中细菌的生长曲线也可证明这一观点。第三，施添加显著降低土壤pH值。较低的土壤pH会降低分解速率，促进土壤碳的储存。

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