原名：Identification of bacteria-derived HLA-bound peptidesin melanoma

译名：黑色素瘤中细菌源性HLA结合肽的鉴定

期刊：Nature

IF：42.778

发表时间：2021.03

通讯作者：Yardena Samuels

通讯作者单位：以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所

1 黑色素瘤中发现的细菌种类

利用16S rRNA基因测序，我们从来自9名黑色素瘤患者的17个黑色素瘤样品中鉴定出了41种不同的细菌。微生物系统发育树实验表明：同一患者的不同转移瘤中发现的细菌组成具有高度相似性，并且在不同患者的样本中也发现了这种相似性。这一发现指出了黑色素瘤常见的细菌种类的存在（图1）。我们补充了一个黑色素瘤全基因组测序数据集的分类图谱，共包括108个成对的肿瘤和血液样本，重点放在与人类基因组不匹配的DNA序列上。尽管肿瘤和血液样本中细菌计数比例相同（P=0.52），但在肿瘤样本中物种群落丰富度更高（P=0.0045）（补充图1a）。此外，肿瘤样本中的细菌成分比血液样本中的细菌成分更为保守（补充图1b），肿瘤样本中有7类菌属表现出更高的丰度（补充图1c，d）。在我们的队列中还发现了不动杆菌属、放线菌属、棒状杆菌属、肠杆菌属和链球菌属的8种细菌，支持我们在黑色素瘤肿瘤中确定的微生物组成。

图1 来源于9例患者的17个黑色素瘤转移灶细菌组成的系统发育树图解。该分析基于16S rRNA基因测序。圆圈中不同的颜色和阴影表示细菌在属（内圈）、目（中圈）和门（外圈）级别上的不同分类。每个病人都有颜色编码（如索引中所示），同一病人的不同转移瘤用同一颜色的不同阴影来描述。

补充图1 黑色素瘤全基因组测序数据集分类图谱中的菌群差异。（a）α多样性，以肿瘤（绿色）或血液（紫色）样本中观察到的物种数量来衡量，P值源于肿瘤和血液分类多样性之间配对双尾Wilcoxon检验。（b）组内和组间微生物组的相似性。Bray-Curtis相异度在每对样品之间被测量，然后分为四组，P值源于双尾Wilcoxon检验。（c）肿瘤和血液样本相对丰度的比较。肿瘤和血液分类丰度之间配对双尾Wilcoxon检验的P值。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。(d）在c图中绘制的肿瘤样本中更具体的细菌群列表。P值源于肿瘤和血液分类丰度之间配对双尾Wilcoxon检验。带*的P值在多重假设校正后呈现（错误发现率为5%）。

2 细菌肽的测定

我们对通过16S rRNA分析进行测序的同一肿瘤的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）I和II类组成部分进行了HLA肽组分析。基于相应肿瘤中鉴定出的细菌物种的蛋白质组以及人类蛋白质组，使用MaxQuant软件搜索来自每个HLA肽组的原始数据。我们通过肽的质量鉴定和与患者HLA等位基因的匹配能力对肽进行了筛选。该分析显示了248种独特的HLA-I相关肽和35种独特的HLA-II相关肽。总的来说，我们从每个转移瘤中获得了0至16个HLA-1和HLA-II肽，从每种细菌中获得了0至45个不同的HLA-1和HLA-II肽（图2a）。我们鉴定了11种HLA-I相关循环肽，它们来自Fusobacteriumnucleatum, Staphylococcusaureus 和 Staphylococcuscapitis。其中五种多肽出现在同一患者的不同转移灶中，六种出现在不同的患者中（图2b）。如预期，患者共有的循环多肽被测定与这些患者共有的HLA等位基因结合或包含相同的HLA结合基序。在大多数样本中，匹配HLA-C*03:04、HLA-C*03:03和HLA-A*02:01等位基因的每个样本的细菌肽百分比高于匹配相同等位基因的人类肽百分比（图2c）。在HLA-C*03:04和HLA-C*03:03中，即使考虑到HLA分子的RNA表达，细菌肽的百分比也较高。与人源HLA肽组相比，细菌源肽有更明显的疏水性（P=3.71×10⁻⁴⁶），这一特性可能使这些肽更利于T细胞抗原呈递和识别。重要的是，我们发现细菌蛋白质组含有比人类蛋白质组更高比例的疏水性氨基酸，并且HLA-C*03:04、HLA-C*03:03和HLA-a*02:01等位基因与更疏水的肽结合，这就解释了为何这些等位基因呈现的细菌肽的频率较高。

图2 细菌肽的特征。（a）每个患者样本中HLA-I和HLA-II上呈现的细菌肽数量（顶部显示的患者数量）以蓝色刻度表示（左侧）。白色表示样品中未发现肽，灰色表示转移中未发现细菌。每种细菌的HLA-I和HLA-II肽总数见右侧条形图。以红色标记的物种名称是已知的细胞内细菌。（b）表明在同一患者或不同患者的少数转移瘤中鉴定的细菌肽。样本中鉴定的肽标记为绿色，白色表示样本中未鉴定的肽（尽管转移瘤具有此肽呈现所需的HLA等位基因和细菌种类）。灰色表示样本缺乏HLA等位基因和细菌来产生肽。（c）对于每一个转移，与患者的每个HLA-A（左）、HLA-B（中）或HLA-c（右）等位基因相匹配的细菌肽和人肽的百分比被指出。将具有最佳百分比秩结合预测的等位基因通过NetMHCpan分配给每个肽。

由于我们使用大量黑色素瘤进行HLA肽组学分析，我们无法确定细菌HLA肽是来自黑色素瘤细胞还是抗原呈递细胞。为了解决这个问题，我们消化了两个黑色素瘤肿瘤以得到单个细胞，随后我们根据它们的CD45标记物将其分为两个群体：免疫细胞（CD45⁺细胞）和非免疫细胞（CD45^-细胞，主要是黑色素瘤细胞）。如前所述，我们研究的黑色素瘤细胞不仅表达HLA-I，而且还表达HLA-II分子。我们对不同人群进行HLA肽组分析，识别CD45^-人群中的HLA-I和HLA-II肽（CD45^-和CD45⁺人群间有一些重叠）（图3a）。尽管之前已经证明细菌可以进入抗原呈递细胞并被HLA分子呈递，但我们想评估我们在队列中鉴定的细菌是否也被抗原呈递细胞呈递。为了验证这一点，我们将抗原呈递细胞、B细胞系IHW01070和THP1细胞与有核梭状芽胞杆菌共培养，并进行HLA肽组学研究。为确保我们鉴定的HLA肽确实是HLA配体，我们将HLA-I-null B细胞系721.221与有核梭状芽胞杆菌共培养，并进行HLA肽组学研究。如预期所示，我们仅在过度表达HLA-A*01:01等位基因的细胞中观察到HLA-A*01:01细菌肽；在没有过度表达HLA-A*01:01的721.221细胞中未发现这些肽。HLA-II在两种基因系中的表达没有差异。

图3 细菌进入黑色素瘤细胞并被呈递的证据。（a）肿瘤422被消化，CD45+和CD45-群体接受HLA肽组学分析。下表列出了每个样品中鉴定的肽。（b）免疫荧光染色法检测51AL细胞中的细菌，用抗HLA抗体（红色）染色，并与梭状芽胞杆菌（绿色）共培养。细胞核用DAPI（蓝色）染色。左侧，z-堆栈中心的代表性合并图像，放大63倍。右，z-stack 3D图像（细菌，绿松石色；黑色素瘤细胞，洋红色；细胞核，蓝色）。（c）我们将55A3细胞与有核梭状芽胞杆菌（绿色）共同孵育。细胞核用DAPI（蓝色）染色。超薄切片用CLEM分析。左边，细胞内细菌的区域用黑框标出。（d）分别与梭状芽胞杆菌和S. caprae共培养的51AL和55A3细胞系中HLA肽组学鉴定的细菌肽数。分别敲除B2M和CIITA（KO）降低HLA-I和HLA-II水平。与加扰对照组相比，B2M或CIITA基因敲除的细胞显示出较少的细菌肽。以侵袭性较小的细菌（动物乳杆菌和植物乳杆菌）为对照，证明所鉴定的肽是由细胞内细菌产生的HLA配体。（e）从梭状芽胞杆菌的黄氧还蛋白氧化还原酶蛋白中提取的不同肽。蛋白质序列被描述到第900个氨基酸，而不是蛋白质的末端（总共1188个氨基酸），因为在蛋白质的这个区域之后没有发现肽。

3 细菌进入黑色素瘤细胞

为了全面评估黑色素瘤细胞是否能呈现细菌HLA肽，我们首先确认了在黑色素瘤患者队列中鉴定的细菌种类能够进入黑色素瘤细胞；为此，将来自同一黑色素瘤肿瘤的原代细胞系与具有代表性的胞内细菌（鉴定了HLA肽的细菌）共培养，并使用几种正交方法评估细菌进入细胞的情况；对51AL和55A3黑色素瘤细胞与需氧生长的Staphylococcus caprae厌氧生长Actinomyces odontolyticus共培养物进行庆大霉素保护试验，并在感染后4小时和8小时检测菌落形成单位。作为对照，我们使用在有氧条件下生长的动物乳杆菌和在厌氧条件下生长的植物乳杆菌作为代表性细菌种类。预计这两种细菌都具有较弱的细胞侵袭表型，因此使用庆大霉素保护试验，结果观察到这些细菌对51AL和55A3细胞的侵袭比S. caprae和A. odontolyticus少。我们使用抗脂磷壁酸对51AL和55A3 GFP表达细胞进行免疫荧光染色，进一步验证了黑色素瘤细胞内是否存在细菌（图4）。同时，我们使用无铜点击化学，用DIBO–Alexa Fluor 48832标记厌氧生长的F. nucleatum和 A. odontolyticus，并将这些细菌与用抗HLA-I染色的51AL和55A3细胞共培养（图3b）。我们在两种黑色素瘤细胞系中都检测到了三种细菌。我们对与F. nucleatum、A. odontolyticus和S. caprae共培养并用抗脂磷壁酸染色的细胞进行相关的光学和电子显微镜分析，证实细菌确实进入黑色素瘤细胞（图3c）。

图4 与需氧生长细菌共培养的黑素瘤细胞的免疫荧光染色，证明了细菌进入细胞的能力。（a）将表达绿色荧光蛋白（GFP）的黑色素瘤细胞与需氧细菌S.caprae、S.capitis或S.succinus共培养，用抗菌抗体脂磷壁酸（LTA）染色（红色），细胞核用DAPI染色（蓝色）。白色箭头表示进入黑色素瘤细胞的细菌的位置。（b）表达绿色荧光蛋白（绿色）的51AL细胞的代表性图像，与S.caprae共培养，在没有一级LTA抗体（红色）的情况下染色，排除非特异性染色。图像以63倍放大率显示。比例尺：10 μm。图像代表至少三个独立实验。

4 细菌表现具有特异性

我们评估了是否可以利用肿瘤中鉴定出的细菌来鉴定51AL细胞与F. nucleatum和55A3细胞与S. caprae共培养中相应患者的细菌源性HLA结合肽。对这些共培养物进行HLA肽组分析，发现与细菌共培养的细胞中有105个HLA-I和130个HLA-II肽。使用基因组编辑敲除细胞中的β-微球蛋白或II类主要组织相容性复合物反式激活子基因分别降低了HLA-I和HLA-II的表达，并导致与细菌共培养后的HLA-I-和HLA-II相关肽的数量减少（相较于加扰非靶向单导RNA控制的对照组）（图3d）。此外，将细胞与植物乳杆菌或动物乳杆菌共培养（它们的细胞侵袭性小于F. nucleatum和 S. caprae）产生更少的HLA-I和HLA-II结合肽（图3d）。为了控制HLA免疫纯化过程中的非特异性污染，我们使用与共培养相同的量对细菌颗粒进行HLA肽组分析，并没有或很少观察到肽，即这些肽在共培养样品中均未检出。HLA基因敲除和侵袭性较小的细菌对照实验都表明，我们鉴定的细菌肽是HLA配体，因为在两个对照实验中，它们的存在都大大减少。

5 分离肿瘤后的细菌表现

为了进一步验证我们培养细胞的研究结果，我们从黑色素瘤肿瘤中分离出细菌，并鉴定特定的分离菌株是否能侵入黑色素瘤细胞。庆大霉素保护试验和从肿瘤中分离的细菌的免疫荧光染色实验均显示，这两种细菌都侵入黑色素瘤细胞（图4）。我们将来源于肿瘤58A的头孢菌素与来源于该肿瘤的黑色素瘤细胞系共培养，并对其进行HLA肽组分析，鉴定出了13种HLA-I和11种HLA-II细菌肽。我们对从肿瘤中分离的细菌和用于共培养的细菌进行了全基因组测序。然后，我们从全基因组测序数据构建了一个蛋白质组数据库，并以类似于UniProt数据库的方式分析了HLA肽组数据。在大多数实验中，两种分析中确定的肽的重叠程度很高，这表明使用已发表的蛋白质组，即使它们不是在肿瘤中确定的特定菌株，也可以为足够接近的肽提供鉴定。这强调了尽管使用从肿瘤中分离的细菌的特定菌株衍生的数据库来增加特异性（使用16S rRNA测序和UniProt数据库的组合）具有明显的优势，但是避免了从肿瘤中分离和测序细菌的需要。

6 反复出现的细菌肽

我们能够在共培养细胞系的HLA肽组中鉴定出两种HLA-I肽，这两种肽也在相应的肿瘤样本中被鉴定出来：GLDLGTLTY（在51号患者的27号转移灶中被鉴定）和GVDLGTLTY（在同一患者的51BR号转移瘤被鉴定，在与F. nucleatum共培养的51AL细胞中也发现了此肽）。我们在肿瘤27和与F. nucleatum共培养的721.221细胞中鉴定了ETTLVTEY。我们发现另外两个肽：IASDVSAIL肽（51AL细胞系中）和NSIKIIGDKTDLY肽（与F. nucleatum共培养的巨噬细胞和721.221细胞中）。这表明一些细菌肽可由黑色素瘤细胞和抗原呈递细胞呈递，类似于我们在肿瘤422中观察到的情况：其中我们鉴定了两种肽：EELSRQNL和LSNAKSLEL（分别存在于CD45⁺和CD45^-细胞组中）。此外，我们鉴定了39个细菌蛋白质组，从中我们获得了多种细菌肽（每个基因有2-15种不同的肽）。具有相应的最高数量的不同肽的细菌蛋白质是来自F. nucleatum的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶（图3e）。其中12个为HLA-I肽，3个为HLA-II肽。尽管我们也在巨噬细胞和过度表达HLA-A*01:01的B细胞系721.221中鉴定了一些肽，但我们鉴定的大多数肽来自与F. nucleatum共培养的51AL细胞系。

7 细菌肽具有免疫原性

最近的研究表明，肿瘤微生物群可以通过调节免疫来影响疗效，我们在肿瘤的HLA-I和HLA-II分子上鉴定了来自细菌的抗原，我们推测肿瘤内细菌不仅可以形成免疫肿瘤的微环境，还可以影响T细胞的免疫功能。为了验证这一假设，我们分析了从分析的肿瘤中分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）对我们鉴定的HLA-I结合的细菌抗原的反应性。具体而言，我们评估了肿瘤中鉴定的细菌肽的反应性，这些肽来源于已知通过肽呈递以外的机制对宿主和免疫系统反应产生负面影响的细菌（如：F. nucleatum和 S. aureus），以及反复呈递的细菌肽（基于它们的生物学相关性和在人群中的潜在流行性）。

我们将合成肽脉冲注射到表达肿瘤匹配HLA等位基因的EB病毒转化的B细胞上，将负载的B细胞与自体TILs共培养，使用流式细胞术检测TIL的反应性。我们检测到，与未装载这些肽的对照B细胞相比，八种不同的细菌肽装载下分泌IFN-γ的TILs增加了两倍或更多（图4）。这些包括7个来自51号患者的免疫原性肽和一个来自55号患者的肽。在反应性抗原中，VLTDTYLTL肽在51号患者的两个不同转移瘤中被鉴定，在两个不同的患者中鉴定出两种肽（51号患者的ITELNSPVL和92号患者的SLTDKISII），在同一患者的细胞体外联合培养中也鉴定出一种肽（51号患者的GVDLGTLTY），在同一转移瘤中鉴定出的两种潜在细菌中鉴定出一种肽（ALSDMSLAL来源于Sphingomonas dokdonensis或 Sphingomonas melonis；这两种细菌都在转移瘤55B3中被观察到）。我们通过流式细胞术分析CD69 T细胞反应性标记物证实了这些结果（图5）。

图5 TIL对细菌源性抗原的反应。用流式细胞术检测与负载有细菌肽或二甲基亚砜对照的B细胞共培养6 h后分泌IFN-γ的51AL和55A3细胞。同时检测TILs是否存在CD69反应性标记。该图像显示了4种具有代表性的免疫原性肽，其显示了肽和二甲基亚砜对照物之间至少2倍的变化。分泌IFN-γ或表达CD69的阳性TIL的百分比是三个独立实验的平均值。（a）51号病人。（b）55号病人。

综上所述，我们证明了黑色素瘤患者肿瘤中存在来自细菌的HLA肽，并描述了相关细菌的种类。我们证明了细菌HLA-I和HLA-II肽可以通过抗原呈递细胞和黑色素瘤细胞呈递，方法是将HLA肽组分析应用于CD45^-和CD45⁺群体的肿瘤样本以及与细菌共培养的抗原呈递细胞和黑色素瘤细胞系。在我们确定的肽中，有来自同一患者的不同转移瘤或来自不同患者转移瘤的肽。其中一些抗原与HLA等位基因结合，HLA等位基因在癌症基因组图谱的黑色素瘤队列中普遍存在。此外，一些已鉴定的能引起患者自体TILs免疫反应的肽是循环肽。由于细菌抗原是非自身的，可以作为免疫治疗的靶点。免疫治疗的细菌种类的选择应该仔细考虑，并且应该有利于已知对宿主和免疫系统的反应有负面影响的细菌种类，而不是更具“保护性”的细菌。当我们聚焦于呈现的细菌蛋白质时，我们观察到具有重叠肽的基因，可能表明蛋白质结构域的存在，并可能进一步协助选择免疫治疗靶点的研究。

尽管我们的研究有其优点，但也有一些缺点。具体而言，由于某些细菌的16S序列具有高度的相似性，因此鉴定特定细菌种类所需的分辨率是有限的。我们也承认使用HLA肽组分析鉴定细菌肽的局限性，因为它依赖于肽强度：这有时可能低于检测水平，特别是当样本材料的数量有限时。这也解释了为何细胞系中鉴定出的细菌肽数量较多，因为在这些实验中使用的细胞数量较多。结合大规模队列的临床和治疗信息评估肿瘤内细菌源性肽的研究可能进一步阐明细菌肽的临床作用。

我们对黑色素瘤的瘤内微生物群和来源于这些细菌的HLA肽的综合分析表明，定植于黑色素瘤的细菌可以进入黑色素瘤细胞，并且它们的肽可由黑色素瘤的HLA-I和HLA-II分子呈现。由于这两类HLA分子在CD8⁺和CD4⁺ T细胞免疫中都起着核心作用，因此它们有望最终调节免疫功能。最后，由于肠道和肿瘤微生物群可以影响癌症患者的生存及其对治疗的反应，我们的研究结果具有特别的相关性，其涉及的抗原呈递的机制可能是这些影响的基础。

癌症免疫疗法可能会从一个意想不到的方向得到推动——驻扎在肿瘤细胞内的细菌。这项新研究发现：免疫系统可以“看到”这些细菌，并可利用它们引发针对肿瘤的免疫反应。该研究还可能有助于阐明免疫疗法与肠道微生物组之间的联系，解释了之前研究的结果：即肠道微生物组影响免疫疗法的疗效。