原名：The gut microbiome modulates the protective association between a Mediterranean diet and cardiometabolic disease risk

译名：肠道微生物组调节地中海饮食与心脏代谢疾病风险之间的保护性关联

期刊：Nature Medicine

IF：36.13

发表时间：2021.2.11

通讯作者：Curtis Huttenhower

通讯作者单位：美国哈佛大学陈曾熙公共卫生学院生物统计学系，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所

研究从2011年开始招募，共有914名年龄在45至80岁之间的男性参加了男性生活方式验证研究（MLVS），这些人均无冠心病、中风、癌症或主要神经系统疾病。这一研究是长期健康专家随访研究HPFS（https://sites.sph.harvard.edu/hpfs/）的子研究。从2011年到2013年，307名MLVS参与者提供了两对自己收集的粪便样本，每对粪便样本分别从连续两次排便活动中采集，间隔24至72小时。在第一次收集大约六个月后收集第二对样品。每位参与者将每次的粪便放入装有RNAlater的容器中，并完成一份问卷，详细说明了排便的日期、时间及其他相关暴露。参与者在收集粪便样本时根据Bristol粪便量表对排便形式进行分类。将粪便样品连夜运送到麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的测序中心，并保存在-80°C的冰箱中直至需要提取核酸。采用Illumina HiSeq配对端（2 × 101核苷酸）鸟枪测序平台获得宏基因组和宏转录组数据。在饮食评估和协变量测量方面，从2011年到2013年，在MLVS中收集生物样本的前后三个月分别进行了两次半定量食物频率问卷（SFFQ）。每一种食物的频率和分量都被转换为每个参与者的平均日摄入量。我们通过将每种食物的消耗频率乘以其营养成分的含量，并对所有食物相加，从而计算出平均每日营养素摄入量和总能量摄入量。在这个分析中，我们计算了每个参与者的累积平均膳食摄入量，方法是将所有可用的SFFQ的摄入能量水平的总和除以SFFQ的数量。此外，我们使用MedDiet（地中海饮食）指数来衡量对地中海地区传统饮食方式的依从程度。该指数基于九个项目：蔬菜、豆类、水果、坚果、全谷物、红肉/加工肉、鱼，以及单不饱和脂肪与饱和脂肪的比例，MedDiet的总指数范围从0（不依从）到9（完全依从）。我们通过使用HUMAnN 2.8.0（http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann）对宏基因组和宏转录组进行了功能分析。简而言之，对于每个样品，均使用分类学分析来鉴定可检测的生物。MLVS参与者在采集粪便样本的同时，两次捐献空腹血液样本，间隔六个月。对于每份血液样本，记录禁食状态、采血时间和日期、吸烟情况、体育活动和体重等信息。同时，我们对来自HPFS的396例心肌梗死（MI）病例和843例健康对照者进行了前瞻性设计的巣式病例对照研究，以量化心脏代谢疾病风险评分和个体生物标志物与MI发生风险的关系。利用上述宏基因组和宏转录组的原始功能谱丰度数据，我们通过计算微生物酶的RNA/DNA比率来量化肠道微生物转录的功能活性，从而提供了每个个体微生物组样本的过度/欠缺转录指数（相对于DNA拷贝数）。我们使用线性混合模型进行所有的关联分析，这提供了一种方便的方式来考虑重复测量(每个参与者多个时间点)和少量的缺失的问题。在巢式病例对照研究中，我们量化了心脏代谢疾病风险评分和生物标志物与MI风险的关联。

1 在一项流行病学研究中，对饮食、肠道微生物组和心脏代谢疾病风险进行的长期随访分析

为了研究肠道微生物组在调节MedDiet与心脏代谢疾病风险的保护性关联中的潜在作用，我们从MLVS中评估了307名健康的男性，进行了详细的饮食评估，并收集了粪便和血液样本（见图1和方法部分）

图1 MLVS中饮食、肠道微生物组和心脏代谢疾病风险关联的实验策略。

为了分析该人群中的肠道微生物群，307名MLVS参与者提供了2011年至2013年六个月内的两组粪便样本。这产生了925个鸟枪宏基因组和340个鸟枪宏转录组数据（见图1和方法部分）。在1986年至2013年里，我们反复收集了多达9份经过验证的半定量食物频率问卷(SFFQs)，以收集研究参与者的饮食信息。我们对MLVS还采集了两个时间点的血样，并测量了血红蛋白A1c（HbA1c）和血浆甘油三酸酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和高敏感性C反应蛋白（hs-CRP，见方法部分）。

2 坚持健康的地中海式饮食模式与肠道微生物组的组成和功能有关

每个参与者对MedDiet的依从性通过一个九维的MedDiet指数进行评估，该指数的范围从0（不依从）到9（完全依从，见方法部分）。正如预期的那样，对MedDiet的依从性更高的参与者摄入了MedDiet饮食中更多的有益成分，包括全谷物、蔬菜、水果、坚果、豆类、鱼和单不饱和脂肪；他们相应地减少了红肉和加工肉的摄入，这是MedDiet指数中对人体有害的部分（图2a）。

图2 地中海饮食模式和肠道微生物的分类和功能概况。a，研究参与者坚持地中海饮食习惯的分布（MedDiet）和成分食物和营养素的摄入量水平（n  = 307）。b，分析的宏基因组中平均最丰富的10种微生物的分布（基于925个基因组）。c，5个最丰富的宏基因组DNA途径（顶部）和酶（底部）的分布，以及每个酶或途径的前5个物种的分布（也基于925个元基因组）。d，5个最丰富的宏转录组途径（顶部）和酶（底部）以及对每种酶或途径起作用的前三种物种（右，基于340个转录组和宏基因组对；样本按MedDiet索引排序（从最低到最高）。

总的来说，10个最丰富的物种加在一起平均占群落丰度的46%（图2b）。种群中最显著的肠道微生物分类学变化模式包括拟杆菌门Bacteroidetes（例如单形拟杆菌（Bacteroides uniformis））和厚壁菌门Firmicutes（例如Subdoligranulumunclassified）之间的预期转换，以及预期P. copi -富集的亚群。在我们的研究中，本模式已被检测到并证明与MedDiet和心脏代谢疾病风险相互作用（请参阅下文）。最丰富的编码和转录功能通常代表共同的细胞管家过程，例如碳水化合物、核酸和核苷酸的代谢、维生素的生物合成和遗传信息处理（图2c，d）。

3 坚持地中海饮食对整体微生物组结构和特定微生物种类有适度但显著的影响

尽管MedDiet指数不是肠道微生物组整体结构变异的主要驱动因素（图3a），但对变异性进行排列多变量方差分析（PERMANOVA）（n = 999个排列）后发现，其相关性在分类学（q（错误发现率调整P值）<0.005，图3b）和酶结构（P= 0.001）方面均显著，但在酶转录方面不显著（P = 0.16）。在本次分析中考虑的饮食因素、协变量和心脏代谢生物标志物中，MedDiet指数在分类中占变异的比例第三大（图3b）。

图3 地中海饮食模式与整体肠道微生物组结构以及各个肠道微生物种类的丰富度之间的关系。a，使用物种级Bray-Curtis相异性对所有样品进行主坐标分析。b，分类的变异比例由地中海饮食（MedDiet）指数、饮食因素、血浆生物标志物和协变量解释，并通过方差的双边置换多元分析进行了量化（基于物种水平Bray-Curtis差异）的q值（假发现率调整P值）用所述的Benjamini-Hochberg的方法用0.25的目标速率来计算。c，MedDiet指数及其组成食物和营养素与微生物种类的重要关联（q ≤0.25）。d，植物性食物和红肉/加工肉类的摄入量与微生物物种有显著关联。

我们使用线性混合模型在MaAsLin 2中对功能进行逐一测试，以识别与MedDiet相关的微生物。这些模型从研究的重复抽样设计中考虑了个体内部的相关性，以及在某些时间点的少量观测值缺失（见方法部分）。所有模型将每个参与者的标识符作为随机效应，同时调整潜在混杂因素，包括总能量摄入、年龄、体育活动水平、吸烟、益生菌使用、药物使用（包括抗生素、质子泵抑制剂、阿司匹林、他汀类药物和二甲双胍）和Bristol粪便量表作为固定效应。来自4个门的总共40个物种级特征与MedDiet指数或其组成部分之一显著相关（q ≤0.25；图3c）。一般来说，植物性食物与红肉/加工肉类摄入量的关系是相反的（图3d）。在MedDiet的组成部分中，全谷类、蔬菜、水果和红肉/加工肉是总体饮食模式与微生物特征之间关联的主要驱动力（图3c）。

4 地中海饮食的依从性尤其影响微生物植物多糖降解潜能、短链脂肪酸的产生和果胶代谢

   接下来，我们研究了MedDiet与肠道微生物群落功能潜力的关系，即从宏基因组中量化酶和代谢途径。我们发现，MedDiet及其成分与36条通路和188种酶显著相关。MedDiet指数与D-果糖醛酸酯降解的丰富程度呈正相关（PWY-7242，图4a），这是一种降解果胶（一种富含水果和一些蔬菜的可溶性纤维）的机制。这也适用于该途径的一些单独组成酶，如2-脱氢-3-脱氧葡萄糖醛酸激酶（EnzymeCommission （EC）2.7.1.45，图4b）。正如预期的那样，这些途径及其组成酶很大程度上是由不同参与者的厌氧纤维代谢产物所贡献的。相反，我们发现较低的MedDiet依从性与次级胆汁酸生物合成潜能的富集有关。胆汁酸7α-脱羟化酶（EC 1.17.98.1）主要由C. aerofaciens编码，从初级胆汁酸中去除7α-羟基，在地中海饮食模式依从性较差的参与者中富集，特别是那些红肉/加工肉摄入量高的参与者中含量尤其丰富（图4b）。有趣的是，乳糖和半乳糖降解途径I（LACTOSECAT-PWY）和该途径的组成酶（EC 3.2.1.85：6-磷酸-β-半乳糖苷酶）在MedDiet指数较高的个体中显示出较低的丰度（图4b），与低乳制品消费量是MedDiet的一个关键特征相一致。

图4 地中海饮食模式与涉及植物多糖降解和短链脂肪酸产生的微生物过程有关。a， MedDiet及其组成食品和营养与微生物功能（作为MetaCyc途径）的关联，涉及植物衍生的多糖降解、短链脂肪酸（SCFA）产生和乳糖降解。b，MedDiet与微生物基因组中编码的酶（如EC编号）相关的子集，这些酶与植物衍生的多糖降解、SCFA产生、木质素降解、次生胆汁酸产生和乳糖降解有关。c，研究人员使用96个参与者的340个宏转录组和宏基因组对，将MedDiet与1-鼠李糖和果胶降解途径中酶的转录联系起来。

如上所述，长期坚持MedDiet通常在宏基因组功能方面比宏转录组反应有更实质性的变化，后者通常调节更多的短期作用。因此，相对于它们的基因组丰度，只有几种微生物酶（n = 46）被不同程度地转录，并且对MedDiet的依从程度不同。MedDiet的依从性与参与果胶降解的几种其他酶的转录过程有关（图4c）。

5 普雷沃氏菌Prevotella copri转运调节地中海饮食模式和心脏代谢健康之间的保护性关联

为了评估每个参与者的心脏代谢疾病风险，我们得出了一个综合评分，该评分总结了CVD和T2D发病机理的三种公认机制的生物标志物水平：血脂异常、高血糖和炎症。在已有病例对照研究中，心脏代谢疾病风险评分是心梗发生的一个有力的预测指标。在10年的随访期间，得分最高的五分之一参与者发生MI的风险是得分最低者的五倍（风险比（RR）= 4.05，95％置信区间（CI）2.51-6.52，P_趋势 = 9.3× 10 ^-9）。另外，正如预期那样，对MedDiet的依从性与心脏代谢疾病风险评分成反比（P_趋势 = 0.04；图5a）。

图5 普雷沃氏菌（privotellacopri）转运调节了地中海饮食模式与心脏代谢疾病风险之间的保护性联系。a，与心脏代谢疾病风险评分相关的地中海饮食（MedDiet）依从性与第一主坐标轴（PCo1）之间的相互作用。b, P. copri、拟杆菌Bacteroides的分布、MedDiet指数和心脏代谢疾病风险评分对PCo1评分的影响。c，MedDiet依从性与P. copri非携带者和P. copri携带者中MI风险之间的关联。

随后，我们采用了一个测试交互作用/修正效应的统计框架，广泛使用在基于人群的研究中，以检验MedDiet和心脏代谢疾病风险之间已知的关联是否在不同肠道微生物类型的个体中存在差异。值得注意的是，我们还发现了MedDiet指数和P. copri丰度与几个个体心脏代谢生物标志物之间类似的相互作用模式。这一发现表明，肠道微生物功能和分类单元不仅可以应对饮食摄入量，而且可以与之专门相互作用，从而支持基于肠道微生物个性化的膳食干预，以实现更有效地预防心脏代谢疾病的前景。

我们的研究表明，长期坚持健康的地中海式饮食模式会对肠道微生物群整体结构产生微小但显著的影响，这些微生物由系统发育多样性的有机体组成，其途径包括植物来源的多糖降解、短链脂肪酸的产生和次级胆汁酸的产生。几种主要的膳食纤维代谢物，如F. prausnitzii和B.cellulosilyticus，以及它们分解特定膳食纤维（特别是果胶）的功能，在MedDiet依从性更强的参与者的肠道微生物群中都得到了丰富。我们的研究还将MedDiet依从性更强（特别是与低红肉/加工肉摄入量相关）与一些生态位和学科特定的生物化学成分的消耗联系起来，如C. leptum和C. aerofaciens，以及包括次级胆汁酸生物合成在内的功能。这一发现支持了一个前提，即对膳食干预或预防心脏代谢疾病的建议可以根据个人的肠道微生物特征进行调整。

尽管无法从这项观察性研究中确定MedDiet是否与肠道微生物特征有因果关系，但我们的数据间接地允许相当具体的推测和假设产生。此外，我们发现，高果胶含量，特别是水果来源的果胶含量，可能部分解释了MedDiet在塑造肠道微生物功能方面的作用，这表明在具有更强的MedDiet依从性的个体中，果胶降解途径和果胶水解酶的转录富集。广泛由微生物产生和免疫调节的短链脂肪酸是果胶发酵的重要的最终产物。

重要的是，该研究还揭示了新发现的普雷沃氏菌属Prevotella spp.的独特作用：首先，它属于被人们一致认为的独立群落的“肠型”；第二，在不同人群中，P. copri可能带来的健康益处或与疾病风险相关；第三，P. copri具有独特的全球分布亚种，主要由人种地理背景而确定不同的分支，每个分支携带不同的酶来降解膳食纤维和氨基酸。此外，由于我们研究的观察性质，我们不能区分两个备选假设：（1）在P. copri非携带者中，肠道微生物组可能会更有效地代谢MedDiet中的成分，从而提高心脏保护性成分的产量，或者（2）坚持MedDiet的个体获得或保留P. copri的可能性较小，而后者本身就是独立的心脏保护因素。

值得注意的是，我们的分析并未发现MedDiet与P. copri丰度或P. copri携带之间的显著关联，只有饮食和P. copri携带之间的相互作用与心脏代谢疾病风险。另一方面，在坚持传统亚洲饮食的个体中，人们认为P. copri在肠道微生物群中含量丰富，它的存在和确切的基因组成在全球各地因地理来源和生活方式而存在很大差异。重要的是，我们对饮食模式和P. copri之间相互作用的发现，这有可能解释了之前关于其改善葡萄糖稳态和炎症状态能力的矛盾结果，因为这些特性现在看来是依赖于饮食习惯的。

然而，我们再次强调，这项研究本质上是观察性的，许多此类分子流行病学研究都存在这一局限性。与类似的微生物组流行病学概况一样，即使我们在统计模型中对许多潜在的混杂因素进行了调整，我们也无法评估协变量，此外，我们的研究集中在心脏代谢疾病的生物标志物上。这些局限性可以通过结合“自上而下”的人体干预研究和“自下而上”的模型系统实验来解决。前者可以评估具有不同基线微生物组特征（有或无P. copri）的个体在MedDiet干预后发生心脏代谢疾病的风险变化，以及在这种干预后微生物组的变化。后者可能包括在培养过程中干扰多种不同亚型的P. copri，可用替代的植物多糖来源（例如，果胶、纤维素、木质素、抗性与常规淀粉和单糖）来评估生长或代谢情况，或在无菌小鼠中做同样的试验。此外，这种饮食-微生物-表型的相互作用很可能只是许多微生物功能、饮食因素和健康结果之间可能重复出现的模式的一个实例，从而为个性化的微生物介导的健康保护和最终的疾病治疗提供一个更清晰的整体范例。

在本文中，我们从HPFS中分析了MedDiet、肠道微生物组和心脏代谢疾病风险在300多名亚人群中的相互作用。本研究的主要目标是了解MedDiet的依从性与心脏代谢疾病风险之间的关系，及其在不同肠道微生物类型的个体中是否存在差异，其次是了解MedDiet对肠道微生物组的影响。我们首先根据近三十年来每四年收集的饮食信息来量化每个参与者对MedDiet的依从性。其次，我们将其与粪便宏基因组和宏转录组的分类学和功能分析相结合，从每个人的最多四个时间点纵向收集。第三，我们确定了肠道微生物的种类和功能，即由肠道细菌编码和转录的酶和途径，在参与者对MedDiet的依从程度不同的情况下比较差异。最后，我们使用葡萄糖稳态、血脂代谢和炎症的生物标记物评估每个参与者的心脏代谢疾病风险。我们发现，MedDiet与心脏代谢疾病风险的保护性关联在不含P. copri肠道微生物群的参与者中更强。因此，这项研究为人们提供了证据，证明长期的饮食模式会影响肠道微生物组，而且饮食驱动的慢性疾病风险会受到肠道微生物组的调节。