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科研资讯 - Frontiers in Immunology

近日，国际免疫学期刊Frontiers in Immunology「2020 IF: 7.561」在线发表了中国农业大学动物医学院夏春教授课题组题论文：基于猪SLA-I三维结构和多肽组确定PRRS 病毒T细胞表位『Illumination of PRRSV Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes by the Three-Dimensional Structure and Peptidome of Swine Lymphocyte Antigen ClassI，SLA-I』。

Frontiers in Immunology, 2020 IF: 7.561

为了推进细胞毒性T细胞表位（CTL表位）在预防兽医学中的应用，本文集成了蛋白晶体学和免疫学技术、以及通过在无特定病原体猪（SPF猪）上的一系列试验，阐明了SLA-1*1502限制性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CTL表位。

• 首先，通过体外实验组装了肽SLA-1*1502复合物（pSLA-1*1502），并对9条预测的PRRSV肽进行结合测定。

• 随后，阐明了SLA-1*1502复合物与一条高亲和力肽（NSP9-TMP9）的晶体结构。
  晶体结构展示了pSLA-1*1502呈现的肽NSP9-TMP9的构象不同于已知的猪MHC-I 等位基因呈递肽的构象。
  pSLA-1*1502结合肽中的两个连续的脯氨酸使NSP9-TMP9的P3和P4位之间的转折更加突出，并且，pSLA-1*1502的D口袋是结合肽的重要区域。
  

• 在此基础上，根据NSP9-TMP9肽的结构特征以及丙氨酸突变肽亲和力测定结果，确定了pSLA-1*1502结合肽的基序，随后，从四类PRRSV基因株中鉴定了4条能与SLA-1*1502匹配的潜在表位。

• 最后，构建了pSLA-1*1502-NSP9-TMP9四聚体，并用NSP9-TMP9肽免疫SPF猪（SLA-1*1502表型），采用了四聚体技术和ELISA测定IFN-γ表达量确定了该肽为PRRSV CTL表位。

• 此研究拟在从各种猪的重要病毒中鉴定出SLA-I限制性CTL表位，用于设计和研发有效的多肽疫苗。

首先为了阐释PRRSV的CTL抗原表位，作者利用九条预测的来自PRRSV多肽来组装多肽-SLA-I∗1502复合物，最终得到并解析了NSP9-TMP9-SLA-I∗1502的复合体结构。图1，pSLA-I∗1502呈现的NSP9-TMP9多肽构象与已知pSLA-I∗0401和pSLA-3∗hs0202复合物呈现的多肽构象不同。两个连续的Pro残基使NSP9-TMP9的P3和P4之间的转角更加尖锐。pSLA-I∗1502的D口袋很独特，对结合多肽非常重要。

图1. （A）SLA-I*1502与多肽NSP9-TMP9的整体结构。（B）多肽NSP9-TMP9与抗原结合槽中的残基之间的相互作用。氢键用红色虚线表示。（C）多肽NSP9-TMP9的表面模式。P4-Pro和P8-Leu的大部分都位于抗原结合槽之外。

为了确定SLA-I∗1502的多肽结合基序，通过丙氨酸扫描对NSP9-TMP9肽进行了突变，并使用圆二色谱检测了这些突变肽与SLA-I∗1502复合物的稳定性。结果表明：P2-Ala，P3-Ala和P9-Ala突变体的结合稳定性显着低于野生型多肽NSP9-TMP9。同时根据pSLA-I∗1502抗原结合槽和结合多肽的特点，SLA-I∗1502结合多肽的基序预期包含以下组合：X-（S/M/F/W/T/V/I/L）-（L/P/M/F/S/N）-XXXXX-（F/Y/W）。根据此基序对源自四个典型PRRSV毒株全蛋白序列进行扫描和多肽表位预测：第一个分离的毒株VR2332；低毒力毒株HB-13.9；高致病性毒株JXwn06；中国最近一次流行的CHsx1401毒株（图2）。大多数受SLA-I∗1502限制的PRRSV多肽位于ORF1a和1b编码的非结构蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）中。尽管在这四个PRRSV毒株中均存在许多SLA-I∗1502结合九肽（〜90条肽），但在四个毒株中仅发现了30个肽是完全保守的。

图2. 根据pSLA-I∗1502复合物结合多肽的基序，从不同PRRSV毒株中预测符合结合基序的多肽。

为了阐明预测到的PRRSV多肽的免疫原性，首先，构建了pSLA-I∗1502四聚体，使用九头SLA-1*1502基因型的SPF长白猪来检测多肽NSP9-TMP9的免疫原性（图3）。结果显示，在经MLV+NSP9-TMP9免疫的组中，pSLA-I∗1502四聚体和CD8双阳性细胞的比率约为〜0.5-1％，显著高于对照组（P=0.0305）。MLV免疫组明显高于对照组（P=0.0355）；然而，MLV + NSP9-TMP9免疫组与MLV免疫组之间无显着差异（P=0.0538）（图3B）。此外，检测每只猪外周血中猪IFN-γ的表达发现，在所有免疫猪中都可检测到分泌的IFN-γ，但低于所有对照猪中的最低可检测限（图3C）。这些数据表明，NSP9-TMP9作为CTL表位，可以刺激猪产生特异性CTL免疫反应。

图3. 多肽NSP9-TMP9的CTL表位的功能性鉴定。（A）SPF猪的免疫程序。将表达SLA-I∗1502的9只猪分成三组：MLV组，MLV +肽组和空白对照组。为MLV和MLV +肽组注射减毒的PRRSV疫苗作为首次免疫。7天后，向MLV +肽组注射与CFA混合的NSP9-TMP9多肽，并且向MLV组注射与CFA混合的MLV作为第二次免疫。在第14天，向MLV+肽组注射与IFA混合的NSP9-TMP9肽，并且向MLV组注射与IFA混合的MLV作为第三次免疫。对照组的猪分别注射PBS，去离子水和CFA，以及去离子水和IFA。（B）通过流式细胞术检测用PE标记的pSLA-I∗1502四聚体和FITC标记的抗CD8单克隆抗体染色的NSP9-TMP9特异性CTL。（C）通过ELISA检测对照组和免疫组分泌的IFN-γ含量。对照组的分泌IFN-γ含量低于最低可检测限（78 pg/mL）。

总之，该研究通过体外复性筛选了可与SLA-I∗1502结合成复合体的病毒多肽，解析了pSLA-I∗1502的晶体结构，分析了结合PRRSV多肽谱。并使用SLA-I∗1502的四聚体，通过流式细胞术和IFN-γ表达量的测定，鉴定了NSP9-TMP9的免疫原性。这项研究为鉴定SLA-I限制的病毒表位提供了一个系统技术，促进了猪表位疫苗的开发。使用此类策略研究的疫苗可以有效激活CTL免疫，并有可能逐步解决常规弱毒苗的安全性问题，为表位疫苗控制PRRS、甚至非洲猪瘟提供了新途径。

作者信息:

中国农业大学动物医学院博士潘孝成和张念之副教授为该论文的共同第一作者，动物医学院夏春教授为通讯作者。该项目是夏春教授免疫学团队的新成果，得到了国家自然科学基金的资助。

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