aBIOTECH | 魏鹏程团队利用FrCas9系统编辑水稻基因核心启动子

微调基因表达的启动子编辑是作物种质创新的有效途径。真核生物启动子由核心启动子区和上游顺式调控元件组成。富含TA序列的核心启动子区域直接控制基因表达量，其有限变异通常不影响时空表达模式而引起转录本的显著丰度变化，是编辑的理想靶标。但受限于序列特征，常用的G PAM偏好CRISPR系统通常难以用于核心启动子编辑。

近日，安徽省农科院和安徽农业大学的研究人员在aBIOTECH上发表了题为“Developing aCRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice”的研究论文。该研究将来源于啮齿粪杆菌Faecalibaculum rodentium、识别5'-NNTA-3'PAM的II-A型Cas9同源物FrCas9工程化至水稻系统，在拓展PAM位点的同时也展示了对核心启动子区域编辑的潜力，为微调基因表达和种质创新提供了技术支撑。

为了测试FrCas9系统的植物基因组编辑能力，作者在OsPDS基因位点上设计了16个具有所有可能的典型5 ' -NNTA-3 ' PAMs的sgRNA，通过对稳定转化水稻愈伤组织的高通量测序表明，FrCas9编辑效率为1.1%-35.3%，且在TGTA、TATA和AGTA PAM位点编辑效率较高，这与大肠杆菌系统中NNTA PAM的第二个核苷酸上R (R = A/G)的假设偏好一致。

在此基础上，作者在水稻WX基因核心启动子区预测的非典型TATA box (TACAAAT) 序列设计了TGTA PAM的sgRNA，利用FrCas9编辑获得了WXiA和WXiT纯合编辑植株，纯合/双等位突变效率为50%。突变植株中WX表达量显著下调，导致了直链淀粉含量（AC）显著下降。同时，作者使用TATA为PAM的两个相向靶点，实现了FrCas9介导的双向编辑，在核心启动子区产生多重突变和小片段精确缺失。此外，将nFrCas9 (D20A) 突变体与高活性胞苷脱氨酶APOBEC3a和进化的腺嘌呤脱氨酶TadA-8e融合，构建了碱基编辑器A3A-FrBE3和FrABE8e。该研究在植物中建立了FrCas9介导的基因敲除和碱基编辑系统，并实现功能基因核心启动子的高效编辑。

图1 水稻FrCas9基因编辑工具及利用

研究得到安徽省良种攻关（水稻）项目等项目资助。安徽农业大学在读博士生汪慧、硕士生丁健和朱憬妍为本文共同第一作者，安徽省农科院水稻所李娟研究员和安徽农业大学农学院魏鹏程教授为本文共同通讯作者。

引用本文：Wang, H., Ding, J., Zhu, J. et al. Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00157-5

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