aBIOTECH | 陈其军团队优化LbCas12a变体使其在拟南芥基因组编辑中达到实用化程度

Cas12a属于第2大类V型CRISPR/Cas核酸酶，与广泛使用的Cas9（第2大类II型）核酸酶不同，它作为基因组编辑工具有以下几个特性。(1) Cas12a核酸酶与单一CRISPR RNA (crRNA)结合，不需要反式激活CRISPR RNA (tracrRNA)，故而Cas12a的crRNA (~ 42 nt)比Cas9的sgRNA (~ 100 nt)短，易于体外人工合成，有助于基于核糖核蛋白复合物(RNP)进行基因编辑试剂的递送。(2) 已知的Cas12a核酸酶，例如 LbCas12a和AsCas12a，通常识别富含T的PAM序列，这一特性有助于其靶向富含AT的基因组区域，例如启动子区域。(3) Cas12a在PAM序列的远端诱导双链断裂(DSB)，并产生5'突出粘性末端。由于Cas12a诱导的突变远离PAM，故而即使在初始靶位点被编辑后，仍有可能继续作为靶点被再次切割产生DSB。因此，与Cas9相比，由Cas12a诱导的突变倾向于大片段的缺失。(4) 上述靶点可多次切割的特性有助于从基因组DNA中释放同源修复(HDR)模板以及增加HDR重组位点被切割的次数，故而有助于延长HDR修复的窗口期，大幅提高基于HDR的精准基因组编辑。(5) Cas12a蛋白可以加工前体crRNA (pre-crRNA)，这个特性有助于多重基因组编辑。综上所述，Cas12a可以补偿Cas9的不足。

Cas12a自2015年面世以来，已经在植物基因组编辑中得到应用。然而，Cas12a核酸酶对低温的高敏感性和较低的切割活性导致其编辑效率总体上偏低，是其未得到广泛应用的主要障碍。因此，需要通过优化大幅提高Cas12a编辑效率。

近日，中国农业大学生物学院陈其军教授团队在aBIOTECH发表了题为“Enhanced editing efficiency in Arabidopsis with a LbCas12a variant harboring D156R and E795L mutations”的研究论文。在该研究中，作者测试了五种Cas12a变体，发现整合耐低温和高活性变体的一种复合型变体—ttLbCas12a ultra具有最高的编辑效率。令人惊喜的是，通过改变核定位信号(NLS)序列和优化密码子，该变体的编辑效率进一步得到大幅提高。至此，优化后的LbCas12a变体在拟南芥基因组编辑中达到了实用化的程度。

作者通过组合来自耐低温变体ttAsCas12a (E174R)和ttLbCas12a (D156R)的突变，以及来自高活性变体AsCas12a Ultra (M537R和F870L)和LbCas12a Ultra (E795L)的突变，获得了两种Cas12a变体，包括ttLbCas12a Ultra (D156R, E795L)和ttAsCas12a Ultra (E174R, M537R, F870L)。以三种Cas12a变体为对照，包括LbCas12a、ttLbCas12a (D156R)和AsCas12a Ultra (M537R, F870L)，作者针对拟南芥中4个基因的6个靶点测试了这五种Cas12a变体的编辑效率。结果表明，携带D156R和E795L突变的变体ttLbCas12a Ultra在拟南芥中显示出最高的编辑效率，并且可以在22°C生长的拟南芥植物中诱导产生T1代纯合或双等位突变体。

图1 五种Cas12a变体编辑效率的比较

为了进一步提高ttLbCas12a Ultra变体的编辑效率，作者通过优化NLS和密码子两个方法对ttLbCas12a Ultra进行了优化。结果表明，优化后的ttLbCas12a Ultra极大地提高了编辑效率，在ECA3-1、TT4、GL1-2靶点产生纯合或双等位突变体的效率分别达到86.4%、86.2%和98.9%，优化效果令人惊喜。

图2 经NLS和密码子优化的ttLbCas12a Ultra变体大幅提高编辑效率

为了检测突变是否可遗传，作者从T1纯合或双等位突变植株中分离出无转基因成分的T2种子，证明了T1植株中存在的突变是可遗传的。高编辑效率通常意味着高脱靶突变。作者选择了编辑效率比较高的两个靶点来进行脱靶分析，结果没有检测到脱靶突变，这表明经过仔细挑选的靶点能够避免高效LbCas12a变体诱导脱靶突变。

图3 无转基因成分的纯合gl2、tt4 T2突变体表型

综上所述，含有来自耐低温变体(D156R)和高活性变体(E795L)突变氨基酸的复合型变体ttLbCas12a Ultra获得了最高的编辑效率，优化该变体的NLS和密码子进一步大幅提升了编辑效率。优化后的LbCas12a变体可以在22°C生长的拟南芥中高效诱导产生纯合或双等位突变体，这为拟南芥基因或启动子编辑提供了一种有价值的Cas9替代工具，也为LbCas12a在其他植物的高效应用奠定了基础。

本研究主要由博士生辛翠平完成，主要结论是建立在54个载体、近上万个转基因株系(共9027株，平均167株/载体)的分析结果上，工作量巨大。考虑到拟南芥的培养温度偏低，只有22°C左右，故而在拟南芥中测试成功往往意味着相关工具在其他植物中会有更出色的表现。在本研究中，优化核定位信号(NLS)和密码子对LbCas12a变体编辑效率的提升效果令人惊叹。受此结果鼓舞，该团队正在努力回答如下问题：NLS优化和密码子优化哪个更重要？包括Cas12a-Plus、hyper-Cas12a、iCas12a和LbCas12a-RRV等在内的其他LbCas12a变体在拟南芥中是否有更出彩的表现？优化后的Cas12a变体是否能在很大程度上克服其编辑效率过度依赖靶点的缺陷？类似的策略是否适用于国产替代工具(如Cas12i3和Cas12i12)的优化？优化的LbCas12a变体能否用于大幅提升基于HDR的精准基因组编辑效率？

本研究得到了重点研发项目的资助。中国农业大学生物学院博士研究生辛翠平为本文第一作者，陈其军教授为本文通讯作者。

引用本文：

Xin, C., Qiao, D., Wang, J. et al. Enhanced editing efficiency in Arabidopsis with a LbCas12a variant harboring D156R and E795L mutations. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00144-w

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