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Nat Chem Biol｜赖氨酸乳酸化是糖酵解过程中的主要修饰类型

已有 1557 次阅读 2024-8-12 17:00 |系统分类:科研笔记

赖氨酸 L-乳酸化（KL-LA）是一种由 L-乳酸驱动的新型蛋白质翻译后修饰（PTM）。该 PTM 有三种异构体：KL-LA、N-ε-（羧乙基）-赖氨酸（Kce）和 d-乳酰基-赖氨酸（KD-LA），它们在 Warburg 效应和核存在的背景下经常混淆。在该篇文章中作者介绍了用于高效分离的化学衍生化和高效液相色谱分析，以及用于高选择性鉴定的异构体特异性抗体这两种区分这些异构体的方法。证明 KL-LA 是组蛋白上的主要乳酸化异构体，并且受糖酵解动态调节，而不是当乙二醛酶系统不完整时观察到的 KD-LA 或 Kce，还揭示了乳酰辅酶A是L-乳酸化的前体，与KL-LA水平呈正相关。

四川大学等机构《Nature Chemical Biology》期刊发布题为"Lysine L-lactylation is the dominant lactylation isomer induced by glycolysis"的文章，报道了区分乳酰化修饰异构体的方法，并证明了L-乳酸化是糖酵解诱导的主要乳酰化异构体。

研究背景

作者最近发现了一种称为赖氨酸乳酸化（也称Kla，以下简称KL-LA）的组蛋白 PTM，它是由糖酵解衍生的 L-乳酸诱导的，作者认为乳酰辅酶A是连接L-乳酸和KL-LA形成的高能中间体，他们的研究表明，乙酰转移酶 p300 可以使用化学合成的乳酰辅酶 A 作为组蛋白 KL-LA 形成的辅助因子，HDAC-13可以催化赖氨酸脱乳酰化。而目前尚不清楚其他高能代谢物是否有助于体内组蛋白KL-LA。

随后作者发现了组蛋白KL-LA的立体异构修饰赖氨酸D-乳酸化（也称乳酰化，以下简称KD-LA），KD-LA由乙二醛酶2（GLO2）途径的S-d-乳酰谷胱甘肽（LGSH）产生，乙二醛酶1（GLO1）将糖酵解的副产物甲基乙二醛（MGO）与谷胱甘肽偶联形成 LGSH，然后被乙二醛酶2（GLO2）水解产生 d-乳酸并再生细胞谷胱甘肽。MGO具有高度反应性可与多种蛋白质残基反应，包括半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸，MGO加合物之一，N-ε-（羧乙基）-赖氨酸（以下简称Kce）已在组蛋白上报道。KL-LA、KD-LA 和 Kce由于他们分子量和结构很相似，目前无法通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析来区别，因而作者对 Kla 修饰的身份和乳酸辅酶 A 的存在提出了担忧，此外，目前也不清楚KD-LA 和 Kce是否以类似于 KL-LA 的方式响应细胞糖酵解的动态变化。因而作者在该项研究中区分了KL-LA、KD-LA 和 Kce及探讨和验证了其与糖酵解的关系。

糖酵解与结构异构体KL-LA、KD-LA 和 Kce之间的代谢关系

技术手段

实验材料：人 MCF-7细胞、人胚胎肾（HEK） 293T 细胞

实验技术：蛋白质组学、免疫共沉淀等

主要结果

KL-LA是组蛋白上的主要修饰，而不是 KD-LA 和 Kce血浆作者开发了可特异性区分KL-LA、 KD-LA 和 Kce的特异性抗体pananti-KL-LA、pan anti-KD-LA 和 pan anti-Kce，并利用HPLC实现了Kce-肽与 KL-LA 或 KD-LA 肽的分离。为了研究KL-LA、 KD-LA 和 Kce哪个是细胞中最常见的组蛋白标记，作者利用其研发的特异性抗体对细胞中含有同位素标记的的L-赖氨酸进行富集，随后用HPLC-MS/MS进行分析，分析结果表明，细胞衍生肽表现出与KL/D-LA标准肽相同的HPLC保留时间和MS/MS碎裂模式，保留时间与Kce标准肽不一致，说明KL/D-LA是组蛋白上的主要修饰形式，而不是 Kce 。为了进一步研究乳酸化是否以KL-LA 或 KD-LA 的形式存在，作者先用亮氨酸肽酶将亲和力丰富的“重”肽消化为单个氨基酸残基，而后加入“轻” KL-LA 或 KD-LA 氨基酸标准品并使用MTPA-Cl 进行手性衍生化，这引入了一个额外的手性官能团，可增加KL-LA 和 KD-LA间立体化学差异，样品通过HPLC-MS/MS分析，结果表明，来自细胞样品的反应产物与KL-LA反应产物共洗脱，而与KD-LA的反应产物不共洗脱，这说明组蛋白乳酸化的主要形式是L形式而不是D形式。

为了证实这些结果，作者对组蛋白的KL-LA、KD-LA 和 Kce进行了基于SILAC（细胞培养物中氨基酸稳定同位素标记）的定量 MS 分析。在实验中，人 MCF-7 细胞在“轻”和“重”培养基中培养了六次细胞倍增。“轻”细胞用无葡萄糖处理，而“重”细胞用高葡萄糖处理 24 小时。处理后，将来自两种条件的相同数量的细胞合并并进行组蛋白提取。然后使用胰蛋白酶将所得组蛋白样品消化成肽，然后使用其相应的 PTM 特异性抗体富集每种类型的含 PTM 的肽，这些实验鉴定出62个由高葡萄糖诱导的KL-LA修饰的组蛋白肽。且作者注意到核心组蛋白上而不是连接组蛋白的KL-LA对高血糖条件的反应明显更明显。另外作者在对组蛋白使用抗KD-LA或抗Kce抗体富集其相应的肽时，在低糖或高糖培养的细胞中均没有检测到任何带有抗KD-LA或抗Kce的肽，表明野生型细胞的组蛋白中不存在KD-LA 和 Kce（作者评估了每种抗体的富集能力都可有效对相应的肽进行富集）。

KL-LA是细胞组蛋白上普遍存在的PTM

糖酵解差异调节KL-LA、KD-LA 和 Kce

KL-LA、KD-LA 和 Kce都是由糖酵解中间体的前体形成的，然而，这三种PTMs如何动态调节以响应糖酵解的变化尚未得到系统的研究。因此作者在含有不同葡萄糖浓度的培养基中培养人 MCF-7 细胞，并通过蛋白质印迹法检查这些 PTM 的细胞水平。结果发现，组蛋白和非组蛋白上的全局KL-LA水平都是由葡萄糖以剂量依赖性方式诱导的，相比之下，整体KD-LA和Kce水平对细胞外葡萄糖浓度基本上没有反应。作者在通过彻底去除小分子后使用 LC-MS/MS 定量了全细胞蛋白裂解物中这三种异构体修饰的全局水平来进一步验证蛋白质印迹的结果，结果显示，在高葡萄糖条件下，大多数KL-LA修饰肽表现出增加，而与低葡萄糖条件相比，大多数KD-LA和Kce修饰肽没有明显变化，这些发现与蛋白质印迹的结果一致。

糖酵解对KL-LA、KD-LA 和Kce的差异调控

在糖酵解反应中，乳酸辅酶a与KL-LA呈正相关

此外，作者通过抑制烯醇化酶（ENO）或乳酸脱氢酶（LDH）来干扰糖酵解看导致葡萄糖衍生的碳进入乙二醛酶途径并是否同时阻断乳酸的产生，发现抑制LDH活性可能只会消除L-乳酸的产生，但不会影响乙二醛酶途径，POMHEX(POMHEX抑制ENO活性)的剂量依赖性会降低全球KL-LA水平，而KD-LA水平增加，Kce水平受到轻微影响，相比之下，LDH抑制剂（R）-GNE-140降低了整体KL-LA水平，而不影响KD-LA或Kce水平。此外作者还通过 CRISPR-Cas9 技术生成了 GLO1、GLO2 和 GLO1/2 缺陷的人胚胎肾（HEK） 293T 细胞（ MGO 和 LGSH为乙二醛酶途径中细胞代谢中的副产物）培养于含有不同葡萄糖浓度的培养基中，发现KL-LA对葡萄糖浓度有反应，但不受乙二醛酶的调节，而在在缺乏GLO2的情况下，KD-LA被诱导，但它对葡萄糖浓度变化的敏感性要低得多，在没有 GLO1 的情况下， Kce 水平没有变化，因而猜想并也有研究表明可能有其他途径，如醛糖还原酶，有助于在缺乏GLO1的情况下去除MGO，也观察到由于代偿机制，缺乏GLO1的细胞在高糖培养基中培养时，由于代偿机制，不会积累Kce或精氨酸加合物修饰。

在糖酵解反应中，乳酸辅酶a与KL-LA呈正相关

此外作者还在证实了培养细胞中乳酰辅酶A存在的前提下利用对乳酸和葡萄糖进行了同位素示踪实验验证了乳酰辅酶A的代谢转换，结果表明乳酸辅酶A可以从L-乳酸和葡萄糖中代谢衍生。并通过检测ENO或LDH被阻断的细胞中的乳酰辅酶A来验证乳酸辅酶A是否受糖酵解调节并与KL-LA水平相关，结果表明，乳酰辅酶A受糖酵解动态调节，并与KL-LA水平呈正相关。

研究结论

总的来说，作者在该实验中应用了免疫学和分析化学法区分了KL-LA、KD-LA 和 Kce异构体，并通过免疫共沉淀、SILAC蛋白质组学等方法表明，尽管所有三种修饰都与糖酵解途径有关，但KL-LA是细胞组蛋白的主要修饰，也是对糖酵解变化有反应的修饰。