沙门氏菌是种常见的人兽共患病原菌，其可在人巨噬细胞内繁殖而不被杀灭，世界各地的沙门氏菌食物污染日益严重，不仅造成巨大的经济损失，还严重威胁人们的身体健康和生命安全，加之由于耐药菌株的不断出现，关于其代谢调控及致病性的研究越发重要。

复旦大学等高校联手在《The EMBO Journal》期刊发布题为"Acetylation coordinates the crosstalk between carbon metabolism andammonium assimilation in Salmonella enterica"的文章，报道了葡萄糖可调节沙门氏菌的氨同化和毒力。

研究背景

沙门氏菌是种常见的人兽共患病原菌，其可在人巨噬细胞内繁殖而不被杀灭，世界各地的沙门氏菌食物污染日益严重，不仅造成巨大的经济损失，还严重威胁人们的身体健康和生命安全，加之由于耐药菌株的不断出现，关于其代谢调控及治病性的研究越发成为热点。氨同化是在关键酶谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脱氢酶（GDH）的作用下将氨（无机形态的氮素）转变为有机氮（主要是谷氨酸和谷氨酰胺）的过程，生成的谷氨酸和谷氨酰胺又可进一步作为氨基供体参与氨基酸的合成代谢及调控沙门氏菌毒力基因的转录表达，氨同化的改变会明显影响沙门氏菌毒力岛SPI-1/2分泌毒性蛋白的能力，GS/GOGAT和GDT分别在低浓度和高浓度下同化氮，氨同化消耗的能量占细菌ATP的15%以上，这说明了能量代谢与氨同化间的关系，负责氨同化的关键酶GS/GOGAT和GDH被认为是关键的调控节点，而氨同化的上游调节信号由氮营养和碳代谢产物组成。已有研究发现蛋白赖氨酸的乙酰化修饰广泛地发生于从原核的沙门氏菌到人肝癌细胞的代谢酶中，感知细胞营养代谢物的乙酰辅酶A和能量水平的NAD⁺，使细胞能迅速适应外部环境的变化，该研究乙酰化的发现第一次阐明了一种在全细胞水平协同调控代谢的分子机制。

技术手段

实验材料：肠炎沙门氏菌和大肠杆菌。

研究方法：乙酰化生化模拟、质谱定量技术、分子动态结构模拟、葡萄糖应激响应、代谢物分析和动物模型等。

研究内容

用精氨酸残基（GS2KR）取代GS的Lys ¹⁶⁴和Lys ³⁵³以模拟未乙酰化的赖氨酸发现降低了GS的乙酰化信号，将GDH的Lys¹²⁸转换为精氨酸（GDH^K128R）也大大降低了GDH的乙酰化水平，这说明GS的Lys¹⁶⁴和Lys³⁵³和GDH的Lys¹²⁸是主要的乙酰化位点。在培养基中增加的葡萄糖量与乙酰化水平成正比，与其活性成反比，用不可代谢的葡萄糖（2-DG）代替培养基中的葡萄糖，发现不能检测到更多的乙酰化信号，利用含有一个葡萄糖和一个半乳糖单元的乳糖代替培养基中的葡萄糖发现得到的乙酰化信号相对于葡萄糖弱得多，这说明乙酰化信号可能来源于葡萄糖残基。

2.乙酰化激活GS但不激活GDH

在含有去乙酰化酶抑制剂NAM的培养基中培养的沙门氏菌中表达GS，结果发现NAM处理细菌的GS的乙酰化水平增加了约1.5倍，比活性增加了40%，表明乙酰化正向调节GS活性。这些结果与乙酰化模拟GS突变体（GS^{K164Q，K353Q}部分乙酰化和GS^K164Q,K353Q（GS^2KQ）为完全乙酰化）和非乙酰化模拟GS突变体（GS^K164R，GS^K353R为部分和GS^K164R,K353R（GS^2KR）为完全未乙酰化）的特异性活性一致。说明了Lys¹⁶⁴ 和Lys³⁵³是GS的主要乙酰化位点，并进一步表明GS的活性通过Lys¹⁶⁴和Lys³⁵³残基的乙酰化而增加。由于GS活性在高氨环境下由氨介导的腺苷酸化调节，作者研究了在高氨情况下乙酰化和腺苷酸化间可能存在的联系。发现葡萄糖促进GS乙酰化，但对培养基中高氨中的GS腺苷酸几乎无影响，此外，在高氨环境下，GS^2KR和GS^2KQ的活性均未对葡萄糖的变化做出反应，这些结果 证实了乙酰化以依赖于腺苷酸化的方式激活GS的催化能力，表明碳和氨信号之间可能存在串扰机制。

通过对GDH的Lys¹²⁸的精氨酸残基（GDH^K128R）和谷氨酰胺残基（GDH^K128Q）进行的非乙酰化模拟取代，发现GDH^K128R的比活性显著增加，而GDH^K128Q的比活性60%，在NAM存在下培养的沙门氏菌中分离的野生型GDH蛋白的比活性被抑制了40%，而GDH ^K128R 和GDH ^K128Q 的活性对NAM处理无反应，也再次证实了Lys¹²⁸是通过乙酰化调节GDH活性的主要调控位点。

3.GS和GDH的可逆乙酰化功能主要受Pat乙酰化转移酶和CobB脱乙酰酶的调控

为了区分GS和GDH中乙酰化的信号，作者研究了AcP介导和Pat介导的乙酰化对GS和GDH活性的影响。结果发现AcP介导的乙酰化不是影响GS和GDH活性的主要调控机制。通过用重组Pat蛋白体外处理低乙酰化GS等实验发现Pat通过Lys¹⁶⁴激活GS，并通过其乙酰转移酶活性激活Lys³⁵³乙酰化，再结合上NAM处理的沙门氏菌中GS乙酰化水平增加的事实（图1A和2C），这些数据证实了Pat和CobB分别是乙酰转移酶和脱乙酰酶，并且是GS活性变化的原因，GS乙酰化的增加主要是由于Pat乙酰转移酶活性的增加，Pat乙酰转移酶活性随着葡萄糖供应的增加而增加，并在GS乙酰化的调节中起关键作用。

4.GS和GDH的乙酰化计量反应于葡萄糖的供应

作者通过计算乙酰化肽信号与总肽信号的比率，半定量检测了对应于GDH的Lys¹²⁸和GS的Lys¹⁶⁴ 和Lys³⁵³ 的乙酰化水平，结果表明碳源驱动的GS和GDH乙酰化参与了碳代谢与氨同化的调控。

5.Pat介导的乙酰化仅影响腺苷酸化GS，对腺苷酸化无影响

将GS的乙酰化位点Lys¹⁶⁴或Lys³⁵³分别或两者均被乙酰化-模拟谷氨酰胺残基取代，发现腺苷酸化模拟突变体^GSY398S的活性升高，而非腺苷酸化模拟突变体GS^Y398F的活性无变化。此外，从ATase/AR缺失的沙门氏菌菌株（ΔglnE）纯化的低腺苷酸化GS蛋白的相对活性对NAM处理无反应，即使乙酰化水平增加，对GS腺苷酸化也没有影响（图5B），这些结果表明，乙酰化仅影响腺苷酸化GS的活性，而对GS的腺苷酸化水平没有影响。

6.乙酰化诱导腺苷酸-GS和GDH活性变化的MD模拟

为进一步了解腺苷酸化-GS和GDH在乙酰化后的活化机制，进行了分子动力学（MD）模拟，比较了有/没有乙酰化的腺苷酸-GS和GDH的动态行为，并使用DiffNets进一步分析了其轨迹，以准确识别和预测蛋白质变体之间的生化相关差异。发现GS Tyr³⁹⁸  处的腺苷酸化阻止了底物进入活性位点而阻断了底物结合，但乙酰化后底部暴露的底物结合位点可消除腺苷基团的阻断作用恢复了底物的入口隧道。

7.高氨环境促进GS和GDH对葡萄糖的可用性做出快速响应作者将培养于 100 mM 氨和 50 mM 柠檬酸盐的最小培养基（被认为是高腺苷酸化但低乙酰化条件）中预处理至对数相时，转移到含有 100 mM 氨和50 mM 葡萄糖的最小培养基（被认为是高腺苷酸化和高乙酰化条件）中，由于碳源转换，内源性 GS 活性在10 分钟内显着增加，显示 GS 活性对葡萄糖变化的快速反应。

8.GS 和 GDH 的乙酰化平衡了体内谷氨酰胺合成与铵同化，以响应各种碳/氮供应比通过在高葡萄糖和高氨环境下分别培养ΔgdhAΔpat、Δgdh、AΔgdhAΔcobB突变体菌株，观察其生长速率并测定其GS活性，并将将缺失基因质粒转于相应菌株培养，观察其变化，发现适当的GDH活性对于菌株在这些条件下生存是必要的，但过度增加的GDH活性抑制了菌株生长，过量的谷氨酸会抑制细胞生长，此外还发现谷氨酸可以通过GS诱导菌株产生更多的下游谷氨酰胺，这会过度消耗细胞能量并严重损害菌株的生长， 进一步表明乙酰化通过协调GDH和GS的活性在铵同化过程中的微调调节作用。测量在含有在50 mM铵和不同浓度葡萄糖的最小培养基中生长的野生型沙门氏菌、Δpat和ΔcobB突变菌株的稳态生长速率和GDH比活性，以模拟不同的碳/氮（C/N）供应比。结果发现在高铵和高碳条件下，源自葡萄糖驱动的乙酰化导致的 GDH 活性降低应与活化的 GS 协调主要由Pat/CobB介导的可逆乙酰化控制。

9.乙酰化可逆转沙门氏菌GS突变体感染小鼠毒力低的状态

将同窝小鼠口服染色体突变体菌株glnA::glnA ^WT ， glnA::glnA ^Y398S ， glnA::glnA ^2KQY398S ， glnA::glnA ^2KQY398S ‐gdhA::gdhA ^K128Q 和 glnA::glnA ^2KQY398S ‐gdhA::gdhA ^K128R 使其感染，并在感染 4 天后处死，评估肠道和其他器官中的炎症和细菌情况，结果表明乙酰化通过协调GS和GDH的活性来促进沙门氏菌的生长，从而增加其在宿主中的存活率。

研究结论在这项研究中，作者揭示了沙门氏菌中一种可及时控制细胞铵同化和谷氨酸/谷氨酰胺稳态，以应对环境碳源供应的变化的PTM机制。碳源介导的动态乙酰化协调两种关键酶 GDH 和 GS 的活性，通过 Pat 乙酰转移酶和 CobB 脱乙酰酶进行氨同化。葡萄糖剂量依赖性地增强 Lys¹⁶⁴ 和 GS 的 Lys³⁵³ 和 GDH 的Lys¹²⁸ 的乙酰化，并增加或减少各自酶的活性，以协调响应C/N比两种氨同化途径的开关。此外，还发现乙酰化的驱动调节可以恢复腺苷酸化灭活的GS的活性，从而使沙门氏菌能够在宿主中存活。