一、研究背景

鸡蛋蛋白是鸡胚胎生长的必需营养物，在鸡胚发育的不同阶段，部分鸡蛋蛋白被内源酶降解为多肽或氨基酸，而少量蛋白质(即卵清蛋白(OVA))则被鸡胚以完整的形式吸收。糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，N-糖基化在蛋白质折叠、定位、细胞识别和受体调节方面发挥着重要作用。尽管近年发现了一些鸡蛋糖蛋白，但糖基化水平的改变及其对鸡胚胎发育的影响在很大程度上仍是未知的。本研究利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)结合串联质量标签(TMT)标记技术，试图揭示鸡胚发育过程中蛋白和蛋黄蛋白在蛋白质组学和N-糖蛋白组学水平上的定量变化。

二、技术手段

实验材料：产蛋后24h内采集的受精卵的蛋清蛋黄混合样品（CEM），收集的鸡蛋在37.8±0.5°C、相对湿度60%的环境下孵育保存。在D0和D12时随机选取9个受精卵作为实验材料。然后，将0天受精卵在-80℃下保存2h，用刀去除蛋壳、蛋壳膜、蛋黄膜，留下全尺寸的蛋清和蛋黄作为样品。D12的CEM给予类似处理。最后，将9个重复取样的CEM匀浆，然后在- 80°C冷冻以待进一步实验。

研究方法：RP-HPLC、TMT标记技术、N-糖基化蛋白组学

三、主要结果

使研究发现鸡胚孵化12天后，鸡蛋蛋清及蛋黄中主要参与抗菌、离子结合、细胞骨架及增殖等功能的蛋白发生显著改变；用SDS-PAGE结合Pro-Q Emerals 488 对D0、D3、D7、D9、D12、D14和D16的受精卵蛋白和蛋白样品进行染色，结果发现可检测到明显的蛋白条带变化。因为采用D12和D0的受精卵蛋白和蛋黄样品作为对照进行进一步的蛋白组组学和N-糖基化组学分析。研究发现鸡胚孵化12天后，鸡蛋蛋清及蛋黄中主要参与抗菌、离子结合、细胞骨架及增殖等功能的蛋白发生显著改变。

图1. (A) Pro-Q Emerald 488染料凝胶染色的不同孵育期受精卵蛋白和蛋黄糖蛋白谱。(B)样品中每个蛋白质的N-糖基化位点数。

定量蛋白组学共鉴定出592个蛋白，其中417个蛋白具有定量信息。选取丰度变化显著(p<0.05)的CEM蛋白，以D12与D0的倍数变化阈值为>1.2或<0.83。因此，在孵育12天后，163个蛋白被指定为显著上调，56个蛋白在丰度上被指定为显著下调。同时，从153种糖蛋白中鉴定出334个N-糖位点，其中140种蛋白含有292个具有定量信息的N-糖位点。选择显著变化(p<0.05)的糖蛋白时，采用相同的标准(>1.2或<0.83的倍数变化阈值)。据此，29种糖蛋白中的33个糖基化位点被指定为显著上调，而53种糖蛋白的76个糖基化位点在孵卵12天后显着下调。

图2.CEM样品中鉴定的N-糖肽的特征。(A)使用WebLogo衍生的N-糖基化独特序列。(B)基于鉴定的N-糖肽的识别序列基序分布(X≠P)。(C)孵育12天后差异改变的鸡蛋N-糖蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络。未连通的节点被隐藏。(D)生物过程，(E)分子功能，(F)GO.N蛋白质类别的细胞成分在孵育12天后丰度增加或减少。左轴显示了每个GO注释的蛋白质百分比。

结果表明蛋白和蛋黄蛋白在孵育期间被胚胎依次降解并选择性吸收，以满足其营养和发育需要，这增强了剩余未吸收的蛋白和蛋黄蛋白或肽的相对丰度。本研究中发现的大多数上调蛋白表明它们的降解和/或吸收延迟，导致它们的相对比例升高。

孵育12天后发现更多糖基化位点显著下调，说明有多数蛋白发生去糖基化过程，因而为胚胎发育提供更多的碳水化合物来源。值得注意的是，一些主要的蛋白在D12和D0的糖基化水平上有显著的改变，如OVA、卵黄蛋白原、粘蛋白和免疫球蛋白，虽然它们在蛋白组学水平上只有轻微的改变。

图3.(A)N-糖苷比值与蛋白质比值的Pearson相关性。(B)蛋白质丰度归一化前后含N-糖位点肽的变化模式。其中红线、绿线、紫线分别表示糖肽比、蛋白比和校准比(N-糖基化比/蛋白比)。不同的长度代表不同的比例。

KEGG及N-糖蛋白组分析显示，孵卵12d后蛋蛋白的显著变化与碳代谢(gga01200)、糖异生(gga00010)和氨基酸生物合成(gga01230) 3条KEGG途径有关。6个显著变化的蛋白被归类为糖异生途径，而显著变化的N-糖蛋白富集于溶酶体途径(gga04142)。而显著变化的N-糖蛋白富集于溶酶体途径(gga04142),而前有研究表明溶酶体水解酶高度糖基化可减弱其水解能力，由此可见，组织蛋白酶和GNS糖基化程度的降低表明其易被水解，可能导致其在孵育12D分解废物的能力减弱。

显著变化的蛋白质和N-糖蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示：蛋白酶抑制剂(即α-antitrypsin前体、胱抑素和蛇肽酶抑制剂)与其他蛋白质具有高度的相互作用。此外还发现了单个糖蛋白的糖基化水平可能会影响一系列其他相互作用的糖蛋白，从而导致分子功能的改变。

四、研究结论

总得来说，该研究发现D12显著改变的蛋白涉及抗菌、离子结合、细胞骨架和细胞增殖以及胚胎发育，蛋白酶和蛋白酶抑制剂引起的联合和移位效应可能会影响不同鸡蛋蛋白的酶解速率，从而导致不同蛋白组的降解和吸收速率不同，即为胚胎提供营养的蛋清和蛋黄蛋白，会在不同的发育阶段以不同的优先级被降解及吸收，而N-糖蛋白组分析显示，蛋白酶及蛋白酶抑制剂糖基化程度可能会影响鸡胚发育不同阶段的蛋白酶活性及其他糖蛋白的功能，从而使不同鸡胚蛋白酶解速率不同。该研究揭示了蛋白质的降解和吸收率不同与鸡胚发育间的关系，提供了CEM蛋白和糖蛋白在孵育过程中的重要结构信息，为鸡胚在孵育过程中的利用以及食品工业提供了总体看法。

编辑：qingqin H

审核：Patrick Li

参考文献：

Zhu F, Qiu N, Sun H, et al. Integrated proteomic and N-glycoproteomic analyses of chicken egg during embryonic development[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2019, 67(42): 11675-11683.