空军军医大学朱平团队于Science发表“Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity”的研究，首次发现半胱氨酸羧乙基化修饰，并揭示其可产生新抗原诱导HLA限制性自身免疫。强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种自身免疫性疾病，可由新抗原引起，破坏人类的免疫耐受。翻译后修饰(PTMs)已被证明是一种改变蛋白质结构和功能以产生新抗原并诱导后续自身免疫反应的关键机制。然而，AS新抗原形成和致病自身反应的分子机制在很大程度上尚不清楚，需要开发一种系统的方法来分析AS患者中可能的PTMs，并确定与AS相关的负责自身反应性新抗原产生的PTMs，以更好地了解自身免疫性疾病的病因。

图1

    AS患者的蛋白质组中应用了一种开放搜索方法对AS患者的蛋白质组进行了研究，发现了大量非编码氨基酸，表示编码氨基酸与实际残基间的质量差异。结合高分辨率质谱，首次鉴定到经羧乙基化修饰的半胱氨酸残基，这些残基需要3-羟基丙酸(3-HPA)才能在AS患者体内生成新抗原。整合素αⅡb[ITGA2B (CD41)]在Cys96上羧乙基化(ITGA2B- cec96)的溶酶体降解产生羧乙基化肽，这些肽由HLA-DRB1*04呈现，以刺激CD4+ T细胞反应并诱导自身抗体的产生，用ITGA2B-ceC96肽免疫HLA-DR4转基因小鼠可促进结肠炎和椎体骨侵蚀。

    为了鉴定AS患者和健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)中蛋白质非编码氨基酸，测量了编码氨基酸和实际残基之间的质量差异，本次共有643个δ质量簇分布在21716个蛋白质位置上，这些PTMs大多与先前报道的PTMs相符，在AS患者和健康供体中存在相似水平（图3A，B）。值得注意的是，72.021 Da处的δ簇显著增加，这种簇在Cys、Arg和Trp残基上常见，在Cys+72.021上最符合正态分布（图3B，C，D）。在AS患者中，C+72.021显著高于HC（图3E）。同时，AS患者ITGA2B的修饰增加最大，在87、96、161和718位点检测到四个不同的半胱氨酸残基，但只有Cys96修饰，被赋值为ITGA2B 96C+72.021（图3D-G）。已知这四个位置的半胱氨酸残基形成二硫键，因此预测ITGA2B 96C+72.021的质量转移会破坏AS患者ITGA2B的结构和功能（图3H,I）。

图3 半胱氨酸羧乙基化的发现与分布

    72.021的质量位移与C3H4O2的分子式相吻合，半胱氨酸巯基与3-HPA或乳酸(LA)缩合反应的潜在产物，通过硫醚或硫酯键可以产生四种可能的修饰（图4A）。野生型ITGA2B Cys96肽(ITGA2B-wtC96)与3-HPA和LA的体外反应可导致羧乙基化(#1)或羟丙酸化(#5),表明3-HPA可能是底物（图4A，B）。为证实半胱氨酸羧乙基化的发生，使兔子体内产生羧乙基化ITGA2B Cys96 (ITGA2B ceC96)特异性抗体，抗ceC96抗体对羧乙基化肽显示很高的亲和力和特异性（图4C，D）。当ITGA2B在3-HPA存在的293T细胞中短暂表达时，使用抗ceC96抗体可清楚地检测到羧乙基化的ITGA2B（图4E）。为了确认体内半胱氨酸羧乙基化，使用抗ceC96抗体免疫析出AS患者外周血中的内源性ITGA2B（图4F），并使用LC-MS/MS进行分析，结果表明，内源性ITGA2B与合成的ITGA2B肽具有相似的图谱。当与3-HPA孵化后出现羧乙基化的ITGA2B以剂量依赖的方式增加时，半胱氨酸羧乙基化对3-HPA的需求在体外得到进一步证实（图4G）。

图4 3-HPA诱导ITGA2B的半胱氨酸羧乙基化

参考文献：

Zhai Y, Chen L, Zhao Q, Zheng ZH, Chen ZN, Bian H, Yang X, Lu HY, Lin P, Chen X, Chen R, Sun HY, Fan LN, Zhang K, Wang B, Sun XX, Feng Z, Zhu YM, Zhou JS, Chen SR, Zhang T, Chen SY, Chen JJ, Zhang K, Wang Y, Chang Y, Zhang R, Zhang B, Wang LJ, Li XM, He Q, Yang XM, Nan G, Xie RH, Yang L, Yang JH, Zhu P. Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity. Science. 2023 Mar 17;379(6637):eabg2482.