Characterization of the Human Myocardial Proteome in Inflammatory Dilated Cardiomyopathy by Label-free Quantitative Shotgun Proteomics of Heart Biopsies

通过心脏活检的无标记定量鸟枪蛋白质组学鉴定炎症性扩张型心肌病患者的心肌蛋白质组

期刊：Journal of proteome research

影响因子：4.466（二区）

发表单位：德国格赖夫斯瓦尔德大学

发表时间：2011.03.18

研究技术：无标记定量蛋白质组学

研究背景：扩张性心肌病(DCM)是一种慢性心脏病，其特征是左心室或双心室增大并伴有左心室收缩功能降低。它是导致心力衰竭和心脏移植的主要原因之一。

DCM是由慢性病毒感染和随后的免疫介导的心肌损伤引起的。到目前为止，与该疾病相关的人类心脏分子变化大多在基因表达水平上，只有少数研究分析了心肌蛋白质组的整体变化。因此，文章的目的是通过全面定量方法研究炎症性DCM(iDCM)和慢性病毒感染患者蛋白质组的变化。

研究手段：采用无标记蛋白质组分析(LC-MS/MS)对10例iDCM患者、左心室功能和组织学正常的对照组和7例心肌内膜活检(EMB)进行蛋白质组学分析。质谱数据用Rosetta Elucidator数据软件包进行分析。通过与基因表达谱和免疫组化染色法的比较来验证蛋白质组学数据

研究结果：

1、蛋白质酶解效果的优化

为了将会对无标签定量产生重大影响的缺失切割位点的数量降到最低，我们优化了蛋白酶解的条件。下图1A显示了在没有进一步处理的情况下，酶解足以进行细胞培养应用，但不能完成心脏蛋白的完全消化。图2B表明LysC消化和胰蛋白酶（与底物1：10）裂解相结合的效率最高，因此采用这个酶解方案。

图1

2、心脏活检的无凝胶分析所覆盖的蛋白质

对每个患者进行了多次活检的蛋白质提取物进行分析，共有485个蛋白质至少基于2个显著的多肽被鉴定出来，假阳性率为1%。对这些蛋白的亚细胞定位分析显示了线粒体成分覆盖率高，这符合需要能量的心肌细胞预期的高线粒体丰度。因此，所鉴定的蛋白质可以对细胞的代谢和能量状态以及细胞结构和肌肉收缩进行充分的监测。

3、与iDCM相关的蛋白的定量分析

在定量实验开始之前，先检查了实验程序的技术变化情况。对同一样品运行多次，结果表明LC运行有高重复性（图2A），样品制备本身只带来了非常小的方差。（图2B），个体间差异大于技术差异（图2C），然而，由于各组内肽强度的个体间差异与iDCM患者组和对照组之间观察到的差异（图2D）相比要小得多，本报告的蛋白质组分析应该能够揭示与iDCM相关的心脏蛋白谱的变化。只有变化＞1.3倍的蛋白，P < 0.05认为是差异蛋白。

图 2

4、显示idcm相关变化的蛋白质的功能分类

174个蛋白质通过了选择条件，变化的蛋白质大多数与线粒体（34.5%）和细胞骨架（24.7%）蛋白相关。其他改变的蛋白质和细胞核和细胞外蛋白相关。

如图3A所示。氧化磷酸化和碳水化合物代谢包括三羧酸循环是最突出的类别。与对照组相比，参与这些代谢过程和能量产生的大多数蛋白质(图3B)在iDCM患者中的表达水平低于对照组。iDCM患者中还观察到肌节蛋白、细胞骨架蛋白、细胞外基质蛋白水平、胶原蛋白等升高。

图 3 主要受iDCM的影响的生物过程

5、蛋白质组学数据的验证

为了验证蛋白质组学筛选的结果，对同样的样本进行了基因表达分析。在iDCM患者中差异表达的895个基因中，发现了已知在DCM和/或心力衰竭中发生改变的基因(如NPPA、NPPB、MYH7和MYH6)（图4）。基因结果分析与iDCM患者中，氧化磷酸化、细胞周期和细胞组分组织的生物过程变化最显著，此外，与编码肌节/收缩蛋白的相关的基因表达也受到影响，这证明了蛋白质组学结果。

图 4 iDCM患者（白色）与对照组（黑色）心衰标志物的基因表达

对于一些选定的具有功能重要性的候选基因，蛋白质组学和基因表达数据如图5所示。图6中I和VI所示，相比于正常人，iDCM心脏胶原蛋白沉积增加和免疫组化染色强度显著增强。在iDCM患者与对照组中显示出显著不同强度的蛋白和基因中，有45个在mRNA和蛋白水平上被覆盖。其中34例表现出了一致的强度变化，而11例的转录本和蛋白质水平发生了相反的方向的变化。后者富集了已知被加工或翻译后修饰的蛋白质(如肌凝蛋白结合蛋白C或肌动蛋白)，这可能表明蛋白质稳定性或降解的改变。

图 5 选定的基因/蛋白质的基因表达和蛋白水平

图 6 与对照组相比，iDCM患者心脏的胶原沉积显示纤维化有显著差异

研究结论：iDCM伴随着细胞外基质蛋白的重塑，并且参与碳水化合物代谢、三羧酸循环以及氧化磷酸化的线粒体蛋白的数量显著减少。无标记质谱的方法可以用于基于低数量的组织样本等心肌内膜活检来识别蛋白质组中的疾病依赖性改变。

文章链接：

https://www.researchgate.net/publication/50590966_Characterization_of_the_Human_Myocardial_Proteome_in_Inflammatory_Dilated_Cardiomyopathy_by_Label-free_Quantitative_Shotgun_Proteomics_of_Heart_Biopsies

参考文献：

[1] Kline, K. G.; Wu, C. C. MudPIT analysis: application to human heart tissue. Methods Mol. Biol. 2009, 528, 281–93.

[2] Parker, K. C.; Walsh, R. J.; Salajegheh, M.; Amato, A. A.; Krastins, B.; Sarracino, D. A.; Greenberg, S. A. Characterization of human skeletal muscle biopsy samples using shotgun proteomics. J. Proteome Res. 2009, 8, 3265–77.