一种利用外周血单个核细胞(PBMCs)的新生蛋白质组来发现脆性X蛋白质组学生物标志物的新策略

A new strategy to uncover fragile X proteomic biomarkers using the nascent proteome of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)

发表期刊：Scientific Reports

影响因子：4.379

发表单位：舍布鲁克大学

发表时间：2021.07.05

研究手段：BONCAT（双正交非典型氨基酸标记） 无标记质谱

研究背景：

脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）是导致智力障碍和自闭症谱系障碍最常见的遗传原因，目前缺少预后工具。鸟枪蛋白质组学法不能准确测定蛋白质的动态表达，因此，针对最能描述疾病诱导的缺陷的亚蛋白质组构成了一个简单的筛选策略的基础。

FXS是由于脆性X智力迟钝蛋白（FMRP）蛋白的表达缺失。FMRP主要被认为是一个翻译调节因子，与FXS中一些蛋白的改变有关。最近，我们研究发现，FX外周血单个核细胞（PBMCs）的蛋白质合成速率发生了变化。这些观察结果促使我们使用新生蛋白质组来筛选生物标志物。

研究方法：

1、PBMCs蛋白的提取（PBMCs分离，氨基酸标记，双链酸法定量）和新生蛋白的分离

2、用于质谱分析的蛋白质制备（click-it蛋白质反应试剂盒）

3、LC-MS/MS分析、质谱数据分析（MaxQuant软件）、蛋白质组学数据处理(Perseus sofware软件)、生物信息学分析（Panther 分类系统）

4、western印迹法：蛋白质样品在10%的SDS-PAGE上溶解，转移到硝化纤维素膜上，用5%的脱脂奶粉阻断，并与抗体孵育使用增强化学发光(ECL)试剂盒揭示印迹，并使用ChemiDoc(Bio-Rad)成像。

研究发现：

1、结合无标记质谱，纯化和量化7名脆性X男性患者和7名年龄匹配的健康对照组的PBMCs的总蛋白和新生蛋白。蛋白质组学分析鉴定了几种在FXS个体的PBMCs中上调或下调的蛋白。

图1 在脆性X PBMCs中发现了不同表达的蛋白。A，在PBMCs总蛋白质组中鉴定的蛋白的火山图。B，在PBMCs新生蛋白质组中鉴定的蛋白质的火山图。C，脆性X新生蛋白质组和总蛋白质组中差异表达蛋白质数量的维恩图。

2、其中11种蛋白被认为是潜在的生物标志物。

图2 在脆性X PBMCs的新生和总蛋白组中，11个蛋白的蛋白质相互作用网络依次表达。

3、其中5种蛋白被Western印迹法进一步验证。ILK、ATP2A3、ANAXA2和VCL的扰动趋势与质谱检测的扰动趋势一致。此外，ILK(p=0.0250)和ANXA2（0.0394）的差异具有统计学意义。

图3 用western印迹法验证5种候选蛋白

研究结论：利用FMRP缺失引起的已知翻译缺陷来识别FXS中几个潜在的生物标志物，结果表明PBMCs新生蛋白质组非常适合FXS生物标志物的发现。对于更罕见的疾病，使用病理驱动的亚蛋白质组学策略揭示有限的人类样本的生物标志物是可能的。

文章来源：https://doi.org/10.1038/s41598-021-94027-5