细胞周期即细胞生长和分裂的过程，是生命的基本过程。其失调具有破坏性的后果，包括癌症。细胞周期是由蛋白质在时间和空间上的精确调控所驱动的，这会在单个增殖细胞之间产生差异。据我们所知，目前尚缺乏这种细胞间蛋白质组变异性的系统研究。

通过整合亚细胞分辨率下的蛋白质组与单细胞转录组以及在细胞周期中单个细胞的精确时间测量，研究人员提供了人类蛋白质组学异质性的全面性时空图谱，并将其整合到人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）中，将为人类细胞周期和细胞增殖的分子研究提供资源。

本研究首先基于HPA细胞图谱寻找单细胞异质性蛋白质，接着对U2OS FUCCI细胞中表达的异质性蛋白进行靶向单细胞蛋白质组成像和单细胞转录组分析（即成像蛋白质基因组学），以探索单细胞异质性蛋白中有哪些是细胞周期依赖性蛋白，随后对CCD蛋白的表达调控模式、功能等进行了深层次的分析。

图1 研究流程图

对HPA细胞图谱进行分析，发现18%的蛋白质在表达水平或空间定位上存在细胞异质性，且其中65%的蛋白质在不止一种人类细胞系中存在异质性。表明细胞间的蛋白质组变化是由保守的调节机制所控制的。

图2 几种细胞异质性蛋白的免疫荧光图像 

进一步验证这些细胞异质性蛋白有多少与细胞周期进程有关，主要从两个角度进行考察：定位在有丝分裂结构的蛋白、与细胞间期进程有关的蛋白。

从HPA细胞图谱中共鉴定到230个定位在有丝分裂结构的蛋白质。对U2OS细胞中表达的1,180个异质性蛋白，利用免疫荧光和单细胞转录组测序对蛋白的定位和丰度进行深层次分析，共鉴定出320个与细胞间期进程有关的蛋白。 

图3 几种定位于有丝分裂结构中蛋白质的细胞荧光图像

结合单细胞RNA-Seq数据，进一步探索CCD蛋白的时序性调控是否可以归因于转录周期。共鉴定到401个CCD蛋白编码基因，CCD基因和CCD蛋白交集较少，可推测大多数CCD蛋白可能是在翻译或翻译后被调控而不是通过转录组调控的。 

图4 细胞分裂不同时期基因和蛋白的表达水平聚类图

通过蛋白翻译后修饰研究，发现CCD蛋白被调节细胞命运的激酶不成比例地磷酸化，而非CCD蛋白更可能被调节代谢的激酶修饰，可推测翻译后修饰直接调控蛋白的周期性而不影响其转录本的周期。

CCD蛋白互作分析结果显示已知和新发现CCD蛋白之间形成了一个紧密连接的网络，表明这些蛋白参与了相关的生物学过程。

图5 CCD蛋白的互作分析结果图

已知和新发现CCD蛋白有类似的时空表达特异性，所以可以通过已知CCD蛋白了解新发现CCD蛋白的功能。如新发现已知CCD蛋白PC与CCD蛋白TTC21B，表达量都是在G2期时达到峰值，且定位在相同的亚细胞结构中；PC参与细胞增殖和糖异生，并上调表达在几种类型的癌症中；通过此模式可以推测TTC21B的功能。进而更深入地了解细胞增殖的分子效应和细胞周期进程。

图6 CCD蛋白的时空表达特异性分析 

通过分析已有基因表达、功能丧失和癌症预后数据集，进一步验证了新发现CCD蛋白在细胞增殖中的功能。

首先，新发现CCD蛋白对应的基因在增殖组织中的表达水平高于非增殖组织，表明它们与人类组织和癌症的增殖活性相关；其次，CCD蛋白显著富集在细胞生存相关基因上，推测这些基因在细胞增殖中起功能性作用；最后，新发现CCD蛋白包括增殖抑制剂和增殖增强剂，如CD2BP2和FAM50B。

图7 新发现CCD蛋白参与细胞增殖的结果展示

总之，该项研究在空间和时间上更为完整地描绘了蛋白质组学在个体细胞中的变化，为测量和解释单个细胞和亚细胞水平之间的蛋白质组变异提供了基础。研究者相信这将成为一种有价值的资源，有助于更好地理解细胞间变异的协调性和随机性，人类细胞周期，新发现的循环蛋白在肿瘤发生中的作用，以及这些蛋白作为细胞增殖新的临床标志物的潜在应用。