肝脏作为机体最大的实体器官，具有独特的免疫学功能，特殊的肝小叶和肝血窦结构有助于病原体的清除和免疫稳态的维持，肝脏内的多种免疫细胞更是直接、广泛地参与到各类免疫反应中。但这些免疫反应的具体机制和不同免疫细胞在生物活体内的反应、行为往往难以用肉眼直接观察记录。因此，在活体状态下观察研究肝脏生理或病理条件下的免疫反应，从显微层面直接监测不同免疫细胞之间的相互接触及其运动行为的时空动态信息，能够极大丰富人们对于肝脏免疫学的认知，对于进一步探究肝脏的免疫功能具有重要意义。

工欲善其事，必先利其器。为了能够直观的观测生物体内的活细胞运动和功能，光学显微成像技术应运而生。2002年，《科学》杂志同一期上发表了三篇文章，介绍光学显微成像技术在免疫器官的活体动态成像研究中的应用，宣告活体免疫光学成像时代的到来。活体免疫光学成像使研究人员能够通过激光显微镜直接以单细胞分辨率监测和示踪活体组织内免疫细胞的数量与形态、运动与迁移、以及细胞间的相互接触等动态信息，并以图片或视频的方式记录、分析和展示。正如英语中的俗语：“A picture is worth a thousand words”，一图胜千言，这种能够直接看到、“所见即所得”的研究方式使研究者们在理解活体细胞生物学信息方面取得了重大进步。

透过“窗户”使得成像看得更多、更久

目前应用最为广泛的活体显微光学成像方式主要是共聚焦显微成像和多光子显微成像。这两种成像方式均能在不损伤组织或器官的情况下对内部的单个细胞进行观察成像，缺点是两种成像技术的成像深度都十分有限，最新的多光子激光扫描显微成像技术也只能将成像深度扩展至数百微米。一张普通的A4打印纸的厚度约为100微米，即显微光学成像技术最多也只能在10张纸的厚度范围内观察记录细胞运动，而最常用的研究动物小鼠的表皮层厚度就已约1毫米左右，直接成像显然是无法观察到体内器官的。

最简单的肝脏成像方法是直接对腹部进行简单的手术切口，使肝脏暴露，再通过激光显微镜对准成像即可。但这种方式无疑会对机体造成极大的损伤，并且不能进行长时间的成像。早期的研究人员通过这种方法得到了许多突破性的发现，如肝脏内自然杀伤T（NKT）细胞的爬行行为的观察记录。但随着研究的深入，活体长时程成像已成为研究者们的重要需求。

就像屋外的人无法直接透过墙壁看到房间内的情况一样，研究人员们自然而然想到通过打开一扇“窗户”来观察屋内活动。由此，在小鼠腹部皮肤上进行手术，安装一个由钛合金和透明玻片组成的“窗户”，科研人员就可应用激光显微镜透过这扇腹窗观看到肝脏内的精细血管结构和细胞分布，从而构建了能够长时间监测肝脏免疫细胞活动的腹窗模型。这种模型在被广泛应用的同时也不断地被改进完善。华中科技大学的科研团队通过改进“窗户”的材料和结构，使这种模型不仅能够用于激光显微光学成像，还可用于成像深度更深的光声成像技术，同时在成像时能够更好的固定肝脏，减少由于呼吸和心跳带来的焦平面抖动，提高成像的清晰度和稳定性。

通过赋予“身份信息”看得更准、更细

体内的免疫过程通常是多细胞和多分子共同参与的过程。将免疫反应比喻为一个大工厂内的工人齐心协力完成解决一个问题的话，如果所有的工人都穿一样的工服，当你想单独找负责某个环节的工人了解具体情况时就会产生混乱。但如果负责查找问题、传递消息和生产零件等环节的工人各有各的工服工牌，能够一眼就看到的话，这个问题就迎刃而解了。因此，在肝脏免疫活体光学成像研究中，对同一环境中多种免疫细胞和分子通过各自的“身份”信息进行标记，即穿上不同的“工服”，能够极大的提升成像的效率和结果的准确性。

转基因小鼠技术在这方面发挥了重要作用。以肝脏中最大的巨噬细胞群体--枯否细胞为例。表达枯否细胞的“特殊身份”的基因是Clec4f基因，通过基因编辑手段，使这个基因表达的同时连带表达某种荧光蛋白基因，使得小鼠体内的所有库普弗细胞均有这种荧光蛋白，而其他细胞内没有，这就完成了活体内库普弗细胞的特异性标记。通过这种方法，肝脏中的自然杀伤T细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞等免疫细胞也分别实现了特异性的标记。

但是转基因小鼠的构建往往有周期较长和过程繁琐等缺点。研究中更为常用的标记方式是通过小鼠尾静脉直接注射不同荧光基团偶联的抗体来进行细胞特异性标记。例如，库普弗细胞表面有一种特殊的“身份标志”是F4/80配体，能够与F4/80抗体相结合。那么通过将F4/80抗体在体外与不同荧光基团相连接并注射入体后，携带荧光基团的抗体便能特异性与库普弗细胞相结合，从而完成对该细胞的标记。

结合腹窗模型和不同的标记方法，研究人员能够对肝脏生理病理环境中的多细胞间互作及细胞功能调控过程进行长时程、精准且细致的观察研究。

活体光学成像揭示肝脏免疫细胞的运动行为与功能动态信息

如上一篇文章所介绍，肝脏中富含多种免疫细胞，它们各司其职，参与并协调肝脏内的免疫活动。通过活体光学成像，我们对这些细胞的生理功能和动态信息的理解得到了极大的扩展。

肝脏中的库普弗细胞占肝脏非实质细胞的20%左右，形态如梭形，具有吞噬能力强、易于标记的特性。通过荧光基团偶联F4/80抗体标记的方法，科研人员能够直接拍摄到小鼠活体肝脏中库普弗细胞吞噬血液中流动的细菌的过程，并进一步探究了这种捕获行为背后的触发机制是由库普弗细胞表面的补体受体完成的，证明了库普弗细胞的强大吞噬细菌功能，进而提出增强该细胞的吞噬功能可能有助于改善细菌感染病人的临床状态。

CXCR6-GFP小鼠是一种绿色荧光蛋白特异性标记肝脏内NKT细胞的转基因小鼠，对该小鼠的肝脏进行活体光学成像可以看到肝脏内的NKT细胞沿着肝血窦缓慢爬行巡逻的行为。科学家们通过对CXCR6-GFP-非酒精性脂肪肝小鼠模型进行活体共聚焦成像，实时观察NKT细胞与库普弗细胞之间的动态相互作用，发现活化的NKT细胞是吞噬因疾病坏死的肝细胞释放的游离脂质的主要细胞，而不是前面提到的发挥主要吞噬功能的库普弗细胞。该研究为非酒精性脂肪肝这一全球性高发慢性肝病的疾病机制和治疗方案提供了新的思路。

类似的研究在肝脏中的效应T细胞、中性粒细胞和肝窦内皮细胞等免疫细胞中的研究中均有开展。通过不同的转基因小鼠或抗体标记方式和多样化的成像手段，活体免疫光学分子成像为肝脏免疫细胞的监测、调节、清除等功能的探索打开了新的大门。

活体成像在肝脏疾病研究中的应用

非酒精性脂肪性肝病是一种在全球范围内迅速增加的慢性肝脏疾病，伴有肝脂肪变性、炎症、纤维化和严重肝衰竭。然而，因为对于非酒精性脂肪肝的病理生理机制的有限理解，目前临床对其的评估和诊断都尚局限，也未建立有效的治疗策略。在非酒精性脂肪肝疾病模型小鼠中，科研人员通过对小鼠静脉注射特殊的染料来特异性标记肝脏内的脂肪液滴，并通过定制的激光共聚焦显微成像系统观察到了该疾病发展过程中细胞内脂滴的聚集过程，包括脂滴的直径随着疾病发展的变化关系，以及肝细胞由于脂滴挤压导致细胞核移位的形态变化等现象。类似研究有助于对非酒精性脂肪肝疾病发病机制和恶化诱因的理解及预后改善。

肝脏是清除血液中感染细菌或真菌的主要器官，在急性感染中能够迅速反应进行免疫调节。科研人员将分别特异性标记肝血窦内皮细胞和库普弗细胞的两种转基因小鼠模型感染疟原虫并进行活体激光共聚焦显微成像研究，发现循环血液中的疟原虫首先会黏附在肝血窦内皮上并滑向库普弗细胞，破坏其细胞膜完整性。科学家们推测疟原虫孢子体在侵袭肝细胞、感染肝脏期间可能是通过该行为逃过免疫系统的清除。这些研究为肝脏感染的具体机制和临床干预提供了新的潜在靶点。

除此以外，肝脏由于流经的循环血液丰富，一旦机体有肿瘤生长，流落在循环血液中的肿瘤细胞极易越过肝血窦而在肝脏中定植，加之肝脏的免疫耐受微环境，使得肝脏成为极易发生肿瘤转移的器官之一。在研究肝转移肿瘤及其消退机制中，活体成像的应用十分广泛且关键。例如，在肿瘤治疗策略中，抗CD20疗法被广泛使用，但其致使肿瘤消退的机制仍不明确。科研人员对抗CD20治疗后的小鼠进行肝脏活体成像显示，肝脏中库普弗细胞会介导肝血窦中循环B细胞的停滞并吞噬该细胞，从而有效消耗恶性B细胞。由此可见，库普弗细胞在抗CD20治疗中发挥关键作用。

总结：

    活体光学成像技术的发展为肝脏免疫学领域打开了一扇新窗口。如上所述，研究者们通过对肝脏免疫细胞群的光学标记，在肝脏疾病发生、发展或治疗过程中动态可视化免疫细胞之间或免疫细胞与病变细胞之间的相互接触与调节作用，为肝脏病理机制的解析开辟了新视角，对于开发新的免疫治疗策略或优化现有方案提供了新思路。尽管如此，在肝脏免疫光学成像领域仍有许多有待改进的地方。目前，多光子激发显微镜或共聚焦显微镜在成像深度上受到限制，未来具有多尺度和大视场成像能力的光声显微成像技术被期待在肝脏免疫活体成像中发挥重要的补充作用。在未来，科学家们将继续尝试将活体成像与其他技术如基因编辑、便携成像等结合起来用于特定的研究目的，创建兼顾多项性质的新方法。我们相信，活体光学显微成像技术有望在肝脏免疫的探究中大放异彩。

     作者：张智红，袁雪楠

   2023年4月发表于科学网“科普集锦”