多序列比对是进化分析的基础，有时用来区分一组序列之间的差异，但其主要用于描述序列之间的相似性关系，常用的软件有 Muscle / MAFFT / ClustalW / T-coffee。

2004年Robert C. Edgar发表的文章对这几个软件进行了评估，在准确性和速度方面，Muscle的综合性能是最高的。

01 MUSCLE序列比对

Muscle及其他比对软件都可以接受DNA和Protein序列，输出格式默认是FASTA，也可以根据需要指定其他输出类型 ClustalW / GCG MSF / Phylip format。

命令行运行示例：

可以直接用Muscle 建树，树的格式是Newick format，但是能选用的算法有限，推荐还是使用PhyML v3.0 或 MrBayes。

如果需要进行自然选择分析，如利用 CodeML (PAML) 进行选择压力分析，就需要进行Codons方式比对，依然推荐 Muscle：

选择物种对应的密码子表，进行Codons方式的比对后，可以翻译成对应的氨基酸而不会产生内部终止子。需要注意的是输入的CDS必须完整且不含末端的终止密码子。

参考文献：
Robert C. Edgar. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32(5): 1792-1797.

02 Gblocks

Gblocks（Version 0.91b，http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html）用于从多序列比对结果中提取保守位点，以利于下一步的进化分析。尤其是差异比较大的序列，比对后Gaps区特别多，更需要用Gblocks做进一步处理。

Gbloks 有两种使用方式，第一种是交互式的方式（按提示输入文件改变参数），第二种是命令行方式（在命令行中输入参数）。

命令行运行示例：

参数说明 --- 

-t= Default:p

设置序列的类型，可选的值是 p / d / c 分别代表 protein / DNA / Codons，如果前一步的比对选择的是Codons方式，则该参数设置为-t=c；

-b1= Default: 50% of the number of sequences + 1

设定保守性位点必须有 >= 该值的序列数。该参数后接一个 integer 数，默认为序列条数的 50% + 1；

-b2= Default: 85% of the number of sequences

确定保守位点的侧翼位点时，其位点必须有 >= 该值的序列数；

-b3= Default: 8

最大连续非保守位点的长度；

-b4= Default: 10

保守位点区块的最小长度。该值必须 >=2；

-b5= Default: n

设置允许含有 Gap 位点。可选的值有 n / h / a 分别代表 None / With Half / All；

-b6= Default: y (Use Similarity Matrices)

默认使用相似性矩阵，仅适用于蛋白比对序列。

-e= default: -gb

设置输出结果的后缀。

结果文件 ---

参考文献：
Talavera, G., and Castresana, J. (2007). Improvement of phylogenies after removing divergent and ambiguously aligned blocks from protein sequence alignments. Systematic Biology 56, 564-577. 

转自https://www.biomart.cn/news/16/2907477.htm