DNA连接酶（EC 6.5.1.1）以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或配对的粘性末端连接起来，其作用是修复DNA分子中断裂的双链。

粘性末端与平末端示意图

在分子生物学中，它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载体。商业连接酶提供含有ATP和Mg²⁺的反应缓冲液，这两种物质对连接酶活性都是必不可少的。

由于反复的冻融可能会破坏ATP，所以最好将溶液进行分装。

连接反应本身有两个基本步骤：

第一步，DNA末端必须偶然碰撞，并保持在一起足够长的时间，以便连接酶连接它们。低温反应更容易（＞0℃）。所有的分子在更高的温度下移动得更快，如果它们在低温下轻轻地漂浮在溶液中，而不是像在更高的温度下那样呼啸而过，那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端，较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键，有助于保持相对位置。

第二步，酶促反应。DNA连接酶通过两步催化3’-OH与5’-磷酸基团连接。首先，与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核苷酸被转移到5’-磷酸。然后磷酸腺苷键被3’-OH攻击，形成共价键并释放腺苷酸。为了让酶进一步地反应，酶活性部位的AMP必须由ATP补充。

DNA连接酶在25℃时具有最佳活性，但为了让DNA两端保持相对平稳，必须在0℃和25℃之间选择一个折中温度。通常在16℃下1小时是可以的，但是由于将DNA末端连接在一起是反应中最不有效的部分，因此通过将温度降低到4℃来促进这一点可以达到更高的效率。 然而，酶在这个温度下工作非常缓慢，因此需要很长的反应时间（如过夜）。

连接酶作用原理示意图

补充知识：为什么酶有最适温度？

我们知道，来自大肠杆菌或温血动物的酶在37℃左右有一个最佳温度，而来自热源细菌的酶有更高的最佳温度，如Taq酶就是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。

为什么酶有一个最佳温度分布？化学家有一个经验法则，温度升高10℃会使反应速度加倍。这个规则是从Arrhenius方程推导出来的。

基本上，随着温度的升高，反应物的动能也随之增加。这种动能的增加意味着反应物更容易与足够的能量发生碰撞，从而使反应发生，因此温度越高，反应速率越高。

每个生物学家都熟悉酶反应速率与温度的关系，如图所示。

酶最适温度示意图

酶促反应上升阶段：反应速率曲线的第一部分，其中速率随着温度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果这种酶即使在高温下也完全稳定，反应速度也会随着温度的升高而继续增加，直到发生其他事情，比如其中一种反应物变得受限。

酶促反应平衡阶段：反应速率开始趋于平稳，这是由于温度接近该酶变性温度（因此失去活性）。

酶促反应下降阶段：在更高的温度下，酶完全变性，失活。

变性发生的温度取决于酶的结构，而这又与酶的进化起源有关。大肠杆菌的酶已经进化到可以应对37℃左右的温度，而来自热源细菌的酶则被迫进化到可以在更高温度下保持稳定的程度。

因此，酶的最佳温度是基于Arrhenius模式对温度的依赖性（反应越热，反应速度越快）和酶接近变性温度时的不稳定性之间的权衡。

摘自知乎https://zhuanlan.zhihu.com/p/86068145